里氏木霉中小分子RNA對(duì)纖維素酶表達(dá)調(diào)控的作用

梁智偉，王娟，田生禮，王立巖 ，劉剛

1.深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060；2.深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳大學(xué) 海洋科學(xué)系，廣東 深圳 518060

小分子RNA廣泛存在于真核生物中，發(fā)揮諸如基因表達(dá)調(diào)控、降解mRNA等功能。近年來(lái)，在真菌中發(fā)現(xiàn)了多種小分子RNA，如粗糙脈孢霉（Neurospo?ra crassa）中 的 qiRNA 及 milRNA（microRNA like RNA）[1-2]、里氏木霉（Trichoderma reesei）中的milRNA[3]等。與高等真核生物中的情況類似，它們?cè)谡婢邪l(fā)揮的作用也非常多樣，包括調(diào)控基因的表達(dá)、調(diào)控真菌的形態(tài)與致病性等[4-7]。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，在分子水平上對(duì)菌株進(jìn)行改良已逐步取代傳統(tǒng)的誘變選育技術(shù)[8]。里氏木霉是重要的纖維素酶生產(chǎn)菌，有關(guān)里氏木霉纖維素酶合成的調(diào)控機(jī)制在蛋白水平上的研究比較深入，而且在高產(chǎn)菌株選育中獲得了應(yīng)用。如通過(guò)對(duì)調(diào)控因子Cre1、xyR1等進(jìn)行干預(yù)，獲得了高產(chǎn)纖維素酶的基因工程菌株[9-10]。研究表明，里氏木霉中存在RNA干擾（RNAi）機(jī)制中的蛋白，如Ago家族蛋白等；此外，里氏木霉具有通過(guò)RNAi下調(diào)蛋白表達(dá)的能力[11]，說(shuō)明在里氏木霉中存在非編碼RNA的表達(dá)、加工等作用機(jī)制。本課題組前期采用小RNA組測(cè)序和生物信息學(xué)方法，對(duì)里氏木霉中的miRNA進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，鑒定出13個(gè)與miRNA結(jié)構(gòu)相似的小分子RNA（milRNA），其中1個(gè)在組成型培養(yǎng)條件下特異表達(dá)，6個(gè)在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中特異表達(dá)，6個(gè)在2種培養(yǎng)條件下同時(shí)表達(dá)。在誘導(dǎo)條件下，milR3、milR5和milR10的表達(dá)量上調(diào)顯著，分別為組成型培養(yǎng)條件下的 2.2、2.0 和 3.7 倍；milR7 和milR8的表達(dá)量下調(diào)顯著，為組成型培養(yǎng)條件下的0.2和0.4倍[3]。這些結(jié)果表明，里氏木霉中不僅存在與高等真核生物類似的RNAi機(jī)制，而且也具有形成小分子RNA的能力，且某些小分子RNA的表達(dá)與纖維素酶的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。

本研究中，我們挑選其中3個(gè)在纖維素酶表達(dá)受阻遏和誘導(dǎo)條件下均有表達(dá)且表達(dá)水平較高的小分子RNA，通過(guò)對(duì)它們過(guò)表達(dá)和抑制，進(jìn)行功能上的驗(yàn)證，期望能找出參與調(diào)控纖維素酶表達(dá)調(diào)控功能的小分子RNA，為在分子水平上對(duì)里氏木霉進(jìn)行改造提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top10F'購(gòu)自Invitrogen公司；里氏木霉QM9414購(gòu)自美國(guó)模式菌種收藏中心（ATCC）；質(zhì)粒pUC-19購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒pAN7-1由本實(shí)驗(yàn)室保藏（含潮霉素抗性基因hph，是進(jìn)行里氏木霉轉(zhuǎn)化的輔助質(zhì)粒）；重組質(zhì)粒p-Ppdc'-Tcbh1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［將5'-GGATCC-3'突變?yōu)?'-AGATCC-3'的Ppdc'啟動(dòng)子（1534 bp）和Tcbh1（702 bp）終止子插入質(zhì)粒pUC-19而構(gòu)成（圖1A）］。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，用于平板培養(yǎng)時(shí)加入20 g/L瓊脂，用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)加入100 μg/mL氨芐西林（In?vitrogen公司）。

PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g，去皮切碎后加至約1 L蒸餾水中，煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，收集濾液，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂后定容至1 L，滅菌倒平板。進(jìn)行里氏木霉轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)加入100 μg/mL潮霉素。

基本培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，尿素 0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.0016 g/L，ZnSO4·7H2O 0.0017 g/L，CoCl2·6H2O 0.0037 g/L，蛋白胨2 g/L，吐溫80 g/L，葡萄糖20 g/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：組分與基本培養(yǎng)基一致，用微晶纖維素（Sigma公司）20 g/L代替葡萄糖作為碳源。

1.2 菌株的培養(yǎng)

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng) 含質(zhì)粒p-Ppdc'-Tchb1的大腸桿菌在50 mL含氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中于37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)盒和抑制表達(dá)盒后的大腸桿菌Top10F'，涂布于含氨芐西林的LB平板，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行篩選，將篩選到的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌在50 mL含氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中于37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。

1.2.2 里氏木霉的培養(yǎng) QM9414在PDA平板中培養(yǎng)7～10 d，用無(wú)菌水沖洗平板，收集孢子，取1×108孢子于30 mL基本培養(yǎng)基中，于28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；取2.5 mL菌液至50 mL基本培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，作為非誘導(dǎo)組（Con）；同樣取2.5 mL菌液至50 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，作為誘導(dǎo)組（Ind）。

1.2.3 里氏木霉纖維素酶的分泌誘導(dǎo) 孢子培養(yǎng)24 h后，取1.5 mL菌液至30 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，培養(yǎng)條件為28℃、250 r/min。

1.3 小分子RNA過(guò)表達(dá)盒和抑制表達(dá)盒的構(gòu)建

離心收集含重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）提取質(zhì)粒p-Ppdc'-Tchb1。

用真菌基因組DNA快速分離試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取QM9414基因組后，利用引物PCR-milR5、PCR-milR7、PCR-milR10（表1）分別擴(kuò)增pri-milR5、pri-milR7、pri-milR10，以及序列各自的前后約250 bp，并同時(shí)引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。將p-Ppdc'-Tcbh1載體和pri-milR5、primilR7及pri-milR10序列進(jìn)行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶（TaKaRa公司）分別連接載體與序列，獲得小分子RNA過(guò)表達(dá)表達(dá)盒p-Ppdc'-PremilRNA-Tcbh1（圖1B）。

表1 構(gòu)建小分子RNA過(guò)表達(dá)載體所用引物

表2 TuD序列

TuD序列（表2）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，主要由4個(gè)原件構(gòu)成：18 bp長(zhǎng)的StemⅠ，2個(gè)與成熟miRNA互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合區(qū)MBS，與2個(gè)MBS連接的莖環(huán)結(jié)構(gòu)StemⅡ，以及4個(gè)連接StemⅠ、MBS和StemⅡ的Linker（圖1C）。序列兩端分別有SalⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，p-Ppdc'-Tcbh1和TuD序列經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，獲得小分子RNA抑制表達(dá)盒p-Ppdc'-TuD-Tcbh1。

1.4 里氏木霉的轉(zhuǎn)化

里氏木霉的轉(zhuǎn)化按照Wang等[10]的方法進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化時(shí)，將10 μg過(guò)表達(dá)或10 μg抑制表達(dá)盒同時(shí)與10 μg pAN7-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化里氏木霉。轉(zhuǎn)化后將菌液涂布在含100 μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)3～4 d，待長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落，用微生物直接PCR裂解緩沖液（TaKaRa公司）裂解菌絲，利用TuD或milR-PCR驗(yàn)證用引物進(jìn)行PCR，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)盒是否成功轉(zhuǎn)化里氏木霉。驗(yàn)證引物見(jiàn)表3。

1.5 濾紙酶活測(cè)定

濾紙酶活（FPA）測(cè)定方法參考Ghost[12]，以What?man No.1濾紙為底物，測(cè)定D540nm值，每個(gè)樣品測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。1個(gè)濾紙酶活力國(guó)際單位（FPU）的定義為在上述反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需酶量。

表3 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證用引物

1.6 小分子RNA的提取以及加polyA尾和反轉(zhuǎn)錄

用mirVana PARIS Kit（Ambion公司）提取非誘導(dǎo)組（Con）和誘導(dǎo)組（Ind）各樣品的小分子RNA。用S-Poly（T）法處理 miRNA[13]，方法如下：首先用 Poly（A）聚合酶（Ambion公司）于37℃進(jìn)行polyA加尾，反應(yīng)時(shí)間30 min；然后用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶（TaKa?Ra公司）于42℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)時(shí)間30 min；最后于72℃滅活工具酶。得到產(chǎn)物用于qPCR。

1.7 RT-PCR檢測(cè)小分子RNA表達(dá)量

用TaqMan探針?lè)z測(cè)3個(gè)小分子RNA的變化，所用試劑盒為Premix Ex Taq（TaKaR公司）。以18S RNA為內(nèi)參，出發(fā)菌株QM9414為對(duì)照，通過(guò)ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，比較小分子RNA的表達(dá)水平。所用引物及通用探針見(jiàn)表4。

2 結(jié)果

2.1 小分子RNA過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)盒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

為研究小分子RNA對(duì)QM9414產(chǎn)纖維素酶的影響，利用p-Ppdc'-Tcbh1載體分別構(gòu)建了小分子RNA的過(guò)表達(dá)盒（OE-milRNA）和抑制表達(dá)盒（TuD），并轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414，獲得過(guò)表達(dá)小分子RNA重組菌株OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10，以及抑制小分子RNA重組菌株TuD5、TuD7和TuD10。如圖2所示，轉(zhuǎn)入各OE-milRNA的重組菌株擴(kuò)增得到的特異條帶約600 bp，轉(zhuǎn)入各TuD的重組菌株擴(kuò)增得到的條帶略大于250 bp，與理論值相符，并分別與陽(yáng)性對(duì)照大小基本一致，說(shuō)明過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)盒已成功轉(zhuǎn)入QM9414。

表4 qPCR所用引物

圖1 小分子RNA過(guò)表達(dá)盒和TuD序列結(jié)構(gòu)

2.2 小分子RNA的過(guò)表達(dá)和抑制效果

表達(dá)盒轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414后，進(jìn)行熒光定量PCR分析，檢測(cè)OE-milRNA和TuD在轉(zhuǎn)化菌株中的作用，每個(gè)表達(dá)盒選取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，結(jié)果取平均值。圖3A為出發(fā)菌株里氏木霉QM9414及轉(zhuǎn)入空載體p-Ppdc'-Tcbh1的重組菌株的RT-qPCR結(jié)果，說(shuō)明p-Ppdc'-Tcbh1載體不會(huì)影響小分子RNA的表達(dá)；圖3B為OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10過(guò)表達(dá)小分子RNA的結(jié)果；圖3C為TuD5、TuD7和TuD10抑制小分子RNA的結(jié)果。結(jié)果表明，OE-mil?RNA和TuD的轉(zhuǎn)入分別可使小分子RNA的表達(dá)上調(diào)和抑制，且效果明顯。OE-milR5非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)組的小分子RNA表達(dá)量分別為出發(fā)菌株QM9414的7.91和 4.62倍，OE-milR7分別為 2.70和 3.87倍；而OE-milR10的效果最為明顯，與出發(fā)菌株相比，分別提高33.02和133.77倍。TuD5、TuD7和TuD10的表達(dá)量分別是出發(fā)菌株的0.51和0.57倍、0.83和 0.82倍、0.58和0.78倍，對(duì)小分子RNA的抑制效果明顯。

圖2 小分子RNA過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化里氏木霉后的PCR驗(yàn)證結(jié)果A：過(guò)表達(dá)盒轉(zhuǎn)化后PCR驗(yàn)證結(jié)果；B：抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化后PCR驗(yàn)證結(jié)果；M：DNA marker；N：陰性對(duì)照（模板為里氏木霉QM9414的基因組DNA）；1：陽(yáng)性對(duì)照（模板為質(zhì)粒p-Ppdc'-PremilR5-Tcbh1）；2～4：分別為OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10的PCR擴(kuò)增結(jié)果；5：陽(yáng)性對(duì)照（模板為質(zhì)粒p-Ppdc'-TuD10-Tcbh1）；6～8：分別為TuD5、TuD7和TuD10的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 小RNA對(duì)纖維素酶表達(dá)效率的影響

以微晶纖維素為誘導(dǎo)物培養(yǎng)重組菌株，測(cè)定濾紙酶活，以里氏木霉QM9414為對(duì)照，每個(gè)表達(dá)盒選取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，測(cè)定結(jié)果取平均值。圖4A為重組菌株OE-milR5和重組菌株TuD5的誘導(dǎo)產(chǎn)酶情況與里氏木霉QM9414的比較，誘導(dǎo)144 h后，菌株OE-milR5的濾紙酶活較出發(fā)菌株略有下降，是QM9414的0.945倍，說(shuō)明milR5可能對(duì)纖維素酶有下調(diào)作用。但抑制milR5對(duì)酶活無(wú)明顯影響，菌株TuD5是QM9414的1.013倍。

如圖4B所示，重組菌株OE-milR7的濾紙酶活是出發(fā)菌株的1.39倍，明顯高于出發(fā)菌株。重組菌株TuD7的濾紙酶活性改變不明顯，但有下降的趨勢(shì)，其酶活是出發(fā)菌株的0.977倍。說(shuō)明milR7可能參與纖維素酶的調(diào)控。

如圖4C所示，OE-milR10和TuD10重組菌株的產(chǎn)酶能力均無(wú)明顯變化，其中菌株OE-milR10是出發(fā)菌株的1.015倍，菌株TuD10是出發(fā)菌株的1.014倍，表明milR10可能和纖維素酶調(diào)控?zé)o關(guān)。

為進(jìn)一步分析過(guò)表達(dá)和抑制小分子RNA對(duì)重組菌纖維素酶的影響，在不同的產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間取發(fā)酵液上清，測(cè)定濾紙酶活，結(jié)果如圖5A，轉(zhuǎn)入空載體的QM-NEG酶活與出發(fā)菌株基本一致，說(shuō)明載體pPpdc'-Tcbh1不會(huì)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生影響。

誘導(dǎo)初期（24 h），重組菌株和出發(fā)菌株的酶活基本一致。如圖5B、D所示，重組菌株與出發(fā)菌株相比，以及重組菌株與重組菌株間相比，酶活無(wú)明顯變化，說(shuō)明milR5和milR10可能與纖維素酶調(diào)控?zé)o關(guān)。

根據(jù)圖5C，從48 h開(kāi)始，OE-milR7酶活明顯比出發(fā)菌株高，至144 h時(shí)最高，是出發(fā)菌株的1.26倍，之后開(kāi)始下降。TuD7在48～144 h期間，除96 h酶活略高于出發(fā)菌株外，均有下降趨勢(shì)，144 h時(shí)酶活是出發(fā)菌株的0.88倍。進(jìn)一步說(shuō)明milR7可能屬于調(diào)控里氏木霉QM9414纖維素酶的小分子RNA。

圖3 重組菌株與出發(fā)菌株QM9414在非誘導(dǎo)（Con）和誘導(dǎo)（Ind）條件下小分子RNA表達(dá)情況的比較

圖4 小分子RNA過(guò)表達(dá)和抑制后濾紙酶活的比較結(jié)果A、B、C分別為重組菌株OE-milRNA和TuD5、TuD7和TuD10，均取誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)144 h后的發(fā)酵液上清測(cè)定濾紙酶活；顯著性檢驗(yàn)采用雙尾檢驗(yàn)，*P＜0.05

圖5 對(duì)小分子RNA過(guò)表達(dá)和抑制后濾紙酶活在不同時(shí)間的比較A：QM9414與QM-NEG比較；B：QM9414與OE-milR5和TuD5比較；C：QM9414與OE-milR7和TuD7比較；D：QM9414與OE-milR10和TuD10比較

3 討論

較多的研究表明，非編碼小分子RNA廣泛存在于絲狀真菌中，但其功能還需要進(jìn)行充分確認(rèn)和挖掘[14-16]。我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上，通過(guò)小分子RNA過(guò)表達(dá)和小分子RNA抑制技術(shù)，對(duì)里氏木霉QM9414中的3個(gè)小分子RNA在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中的功能進(jìn)行了分析。

對(duì)于小分子RNA的過(guò)表達(dá)方法，許多研究者選擇直接轉(zhuǎn)入人工合成的miRNA產(chǎn)品，如成熟miRNA模擬物（miRNA mimics），能短時(shí)間顯著提高小分子RNA的表達(dá)量；另外，構(gòu)建miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是常用方法之一，與前者相比，成本低，作用時(shí)間更長(zhǎng)，并且能更好地模擬體內(nèi)小分子RNA的加工過(guò)程，效率更高。因此，采用構(gòu)建小分子RNA過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414中更具有應(yīng)用前景。

本工作參照miRNA前體即pre-miRNA加上其側(cè)翼序列的表達(dá)載體構(gòu)建形式[17-19]，根據(jù)Kang等[3]預(yù)測(cè)的約70 bp前體序列，加上其上下游各約250 bp，轉(zhuǎn)入使用里氏木霉強(qiáng)組成型啟動(dòng)子Ppdc的p-Ppdc'-Tcbh1載體，提高了小分子RNA的表達(dá)量達(dá)2.70 至133.77 倍，與 mimics效果接近[20]。對(duì)小分子RNA成功地進(jìn)行過(guò)表達(dá)，說(shuō)明里氏木霉QM9414和動(dòng)植物一樣，存在產(chǎn)生小分子RNA的機(jī)制，進(jìn)一步證明小分子RNA存在于真菌中，并具有調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的作用[21-22]。本研究使用的里氏木霉強(qiáng)啟動(dòng)子Ppdc已應(yīng)用于高表達(dá)其內(nèi)源調(diào)控子基因[10,23-24]和構(gòu)建RNAi載體，介導(dǎo)調(diào)控子基因ace1的沉默[10]。

抑制小分子RNA的策略是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一段與其互補(bǔ)的RNA或DNA序列，該序列與小分子RNA結(jié)合，減少小分子RNA與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而抑制或下調(diào)小分子RNA的功能，如常見(jiàn)的miRNA海綿[25-26]、LidNA[27]和 Tough Decoy（TuD） RNA 序 列等。TuD序列是單鏈RNA分子，主要用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究。另外，為提高序列的穩(wěn)定性和效果，在MBS區(qū)3'端第10和11個(gè)堿基處插入了“ATCT”。從結(jié)果可知TuD序列成功發(fā)揮作用，對(duì)小分子RNA的抑制率最高達(dá)49%，與應(yīng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中效果相似[28-31]，表明里氏木霉與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的小分子RNA結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似，能夠和TuD序列結(jié)合。

對(duì)重組菌株測(cè)定濾紙酶活的結(jié)果表明，milR7可能參與纖維素酶的表達(dá)調(diào)控，其中TuD7酶活下降趨勢(shì)不明顯的原因可能是TuD序列對(duì)milR7抑制效果不佳所致，其表達(dá)量在纖維素酶非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)條件下，分別是出發(fā)菌株的0.83和0.82倍。根據(jù)研究，小分子RNA對(duì)其靶基因起負(fù)調(diào)控作用[32]，因此猜測(cè)milR7是通過(guò)調(diào)控纖維素酶活性的負(fù)調(diào)控因子，進(jìn)而提高纖維素酶的功能。

總之，我們通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)盒，成功地對(duì)里氏木霉中的小分子RNA實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)和抑制。對(duì)重組菌株的纖維素酶產(chǎn)酶能力進(jìn)行分析，結(jié)合小分子RNA的過(guò)表達(dá)和抑制情況，獲得了一個(gè)與里氏木霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控有明確關(guān)系的小分子RNA——milR7。本工作為改善里氏木霉的產(chǎn)纖維素酶能力提供了新的途徑。將小分子RNA調(diào)控和蛋白調(diào)控因子結(jié)合起來(lái)，將有可能通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步提高里氏木霉的產(chǎn)纖維素酶能力。

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