沙眼衣原體質(zhì)粒調(diào)控基因的上游序列有廣泛的ChxR結(jié)合位點(diǎn)

李鵬，于永慧，王濤，何君，朱虹，端青，宋立華

1.病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；

2.解放軍第264醫(yī)院，山西 太原 030001

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是沙眼和最常見(jiàn)的細(xì)菌性性傳播疾病的病原體。在我國(guó)，致盲性沙眼已多年未見(jiàn)報(bào)道，Ct導(dǎo)致的泌尿生殖道感染是常見(jiàn)病，特別是女性感染Ct后易發(fā)生盆腔炎、流產(chǎn)、不孕不育等。近年來(lái)有報(bào)道稱(chēng)Ct感染還可能是宮頸癌的又一病因。由于Ct為專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)和純化困難，Ct疫苗研究一直進(jìn)展緩慢。近年來(lái)Ct減毒活疫苗研究有突破，在短尾猴沙眼模型上質(zhì)粒缺失的Ct A2497株是良好的沙眼減毒活疫苗[1]。在小鼠模型上，Ct L2型、F型和鼠衣原體（與Ct親緣性最高的動(dòng)物衣原體）的質(zhì)粒缺失株也已減毒，這說(shuō)明質(zhì)粒是Ct的關(guān)鍵毒力因子[2-4]。

質(zhì)粒缺失Ct的共有表型是包含體中無(wú)糖原積累。Ct質(zhì)粒約7.5 kb，編碼8個(gè)蛋白（Pgp1～Pgp8），其致病機(jī)制主要是通過(guò)Pgp4調(diào)控Pgp3及至少8個(gè)染色體基因（包括糖原合成酶基因glgA、CT084）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[5]。Pgp4的調(diào)控機(jī)制還不清楚。有意思的是，Koo等報(bào)道了ChxR在大腸桿菌系統(tǒng)中可以激活轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒調(diào)節(jié)基因CT084[6]。ChxR是保守的衣原體蛋白，Koo等認(rèn)為是衣原體特定發(fā)育時(shí)期的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可能與衣原體的潛伏感染相關(guān)，而質(zhì)粒缺失的A2497的典型感染特征是短時(shí)感染。這都說(shuō)明ChxR可能也參與Pgp4調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

ChxR是保守的衣原體蛋白，與大腸桿菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的CpxR同源，但它不含天門(mén)冬氨酸磷酸化位點(diǎn)，是非典型的OmpR/PhoB家族的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。這類(lèi)調(diào)控因子存在于衣原體、螺桿菌、粘球菌、鏈霉菌和聚球藻中，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性不受磷酸化調(diào)控，作用機(jī)制還不清楚。ChxR是自身激活轉(zhuǎn)錄因子[7]，其結(jié)構(gòu)已被解析[8-9]，但對(duì)其調(diào)控靶標(biāo)和機(jī)制的了解仍很有限。我們利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，分析ChxR與4個(gè)Pgp4調(diào)節(jié)基因上游區(qū)的相互作用，有助于理解衣原體質(zhì)粒及ChxR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

沙眼衣原體 L2（434），大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3），載體pCR2.1、pET-21b由本室保存；限制性?xún)?nèi)切酶、高保真DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；LightShift化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒、DNA 3'端生物素標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Thermo Fish?er Scientific公司；TALON金屬親和介質(zhì)購(gòu)自Clon?tech公司。

1.2 ChxR的重組表達(dá)和純化

以沙眼衣原體L2（434）基因組為模板，采用引物 ChxRf（CCggAATTCggCggggCCTAAACATgTg）、ChxRr（CCgCTCgAgTCTAgAAAgCTTTgTATCTTgTTg Ag）和高保真DNA聚合酶擴(kuò)增ChxR基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，與經(jīng)同樣酶切處理的載體pET-21b連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），于37℃在含100 μg/mL青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 D600nm為 0.8，加入 1 mmol/L IPTG 繼續(xù)培養(yǎng) 2 h后，用TALON介質(zhì)純化重組蛋白（洗脫蛋白中加入25%甘油，-80oC凍存）。

1.3 衣原體基因上游序列的探針制備

以L(fǎng)2（434）基因組為模板，用表1中的引物和高保真DNA聚合酶擴(kuò)增5個(gè)基因（glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR）的上游序列（約150 bp），將PCR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證插入序列后搖菌純化重組質(zhì)粒，用BstXⅠ單酶切將質(zhì)粒分割為載體序列和插入序列2個(gè)片段，該DNA混合物直接進(jìn)行3'端生物素標(biāo)記，氯仿異戊醇抽提后，加無(wú)核酸酶水將插入序列亦即探針的濃度稀釋至50 fmol/μL，-20oC保存。

1.4 引物延伸實(shí)驗(yàn)

用引物TTACATTTAAggggCATCTTACC和CTC CCAggCCTCCggCTTT（與glgA mRNA互補(bǔ)），PCR擴(kuò)增glgA的上游序列和部分ORF序列共289 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后作為測(cè)序模板。將與mRNA互補(bǔ)的引物的5'端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）進(jìn)行放射性標(biāo)記，退火后用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與mRNA互補(bǔ)引物的測(cè)序條帶進(jìn)行8 mol/L尿素-6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，通過(guò)引物延伸條帶的位置確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

1.5 寡核苷酸探針制備

為鑒別ChxR與glgA上游序列的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成5條60 bp的寡核苷酸探針，每條探針有30 bp的重疊序列（轉(zhuǎn)錄因子的核酸結(jié)合序列通常小于30 bp），共覆蓋了ATG上游150 bp長(zhǎng)度。探針均為雙鏈，由2條3'端標(biāo)記生物素的單鏈DNA等比例混合后緩慢退火制成。本研究所需引物或探針均由Life Technologies公司合成。

1.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

所有操作按照LightShift化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒（含化學(xué)發(fā)光核酸檢測(cè)模塊）的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系：1 μL重組ChxR（500 ng，含25%甘油），1×結(jié)合緩沖液，2.5%甘油，5 mmol/L MgCl2，50 ng/μL Poly（DI-DC），0.05%NP-40，4 pmol/L未標(biāo)記探針，20 fmol/L標(biāo)記探針，加雙蒸水至10 μL總體積。

2 結(jié)果

2.1 ChxR的重組表達(dá)和純化

在大腸桿菌中，重組ChxR若在自身ORF的ATG起始翻譯時(shí)，重組蛋白幾乎全部形成包含體，不利于蛋白純化；若利用pET-21b載體的ATG起始翻譯，則蛋白的溶解性明顯提高，可獲得高純度的重組蛋白（圖1）。重組ChxR的N端有T7標(biāo)簽，C端有6×His標(biāo)簽，可用TALON試劑較好地得到純化。純化的重組蛋白在凍存前要加入終濃度為25%的甘油，否則會(huì)形成聚體沉淀，這可能與此蛋白易形成二聚體有關(guān)。圖1中第1次洗脫的ChxR濃度約為500 ng/μL，其濃度和純度均滿(mǎn)足凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的要求。

表1 構(gòu)建glgA、CTL0071、CTL0305、CTL0339、chxR探針的各組引物

2.2 質(zhì)粒調(diào)控基因的上游區(qū)含有多個(gè)ChxR結(jié)合位點(diǎn)

為鑒定ChxR是否與質(zhì)粒調(diào)控基因的上游序列有相互作用，我們利用上述純化的重組ChxR進(jìn)行了凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（圖2）。文獻(xiàn)已報(bào)道ChxR是自身激活轉(zhuǎn)錄因子[7]，可識(shí)別并結(jié)合自身基因的上游區(qū)，我們因此以chxR上游區(qū)作為陽(yáng)性對(duì)照探針。另外，Koo等報(bào)道ChxR可激活CTL0339（CT084）的轉(zhuǎn)錄[6]，CTL0339探針也因此應(yīng)與ChxR存在相互作用。圖2中chxR探針有4條明顯的阻滯條帶，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。讓人吃驚的是，質(zhì)粒調(diào)控基因的上游區(qū)也有3～6條不等的阻滯帶，其中g(shù)lgA、CTL0071、CTL0305和CTL0339探針的阻滯條帶數(shù)分別為6、4、3和5條，說(shuō)明這幾個(gè)基因的上游區(qū)含有多個(gè)ChxR結(jié)合位點(diǎn)，ChxR可能參與這幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

2.3 引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

糖原合成代謝在衣原體中高度保守，很可能為衣原體的潛伏感染提供關(guān)鍵能量；另外糖原合成酶基因glgA是惟一功能明確的質(zhì)粒調(diào)控基因，我們因此重點(diǎn)探索了ChxR與glgA的轉(zhuǎn)錄之間的可能機(jī)制。首先利用引物延伸實(shí)驗(yàn)鑒定了glgA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcriptional start site，TSS），這對(duì)下一步理解ChxR與glgA上游區(qū)的相互作用很關(guān)鍵?；谏镄畔W(xué)預(yù)測(cè)，glgA上游區(qū)有一個(gè)σ70啟動(dòng)子（TTg ATTATTTTTgTTAAAAgAAATAAT），其TSS因此可能位于-31（glgA ORF中ATG的A設(shè)為+1位，以下均同）（圖3）。引物延伸實(shí)驗(yàn)所需的引物因此設(shè)計(jì)在此位點(diǎn)的下游75 bp處，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明glgA的TSS位于-54位，這與推測(cè)的TSS不同（圖4）。此TSS位于回文序列內(nèi)部，其轉(zhuǎn)錄起始可能受阻遏蛋白調(diào)控。

圖1 親和層析純化的重組ChxR電泳圖譜M：Precision plus protein prestained standards；1～4：分別為層析柱的第1～4次洗脫結(jié)果

2.4 glgA啟動(dòng)子的上下游區(qū)均有ChxR結(jié)合位點(diǎn)

為定位ChxR與glgA上游區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了5條長(zhǎng)60 bp、重疊30 bp的寡核酸探針，根據(jù)TSS推測(cè)的啟動(dòng)子位于第2和第3條探針（圖5A）。圖5B結(jié)果表明探針1～5分別有2、2、1、0和1條阻滯條帶，很明顯多數(shù)ChxR結(jié)合位點(diǎn)位于啟動(dòng)子和啟動(dòng)子下游區(qū)。雖然文獻(xiàn)報(bào)道ChxR是全局轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但本實(shí)驗(yàn)強(qiáng)烈提示ChxR可能是glgA的轉(zhuǎn)錄抑制子。

3 討論

衣原體感染特別是沙眼衣原體感染是臨床常見(jiàn)病，常導(dǎo)致沙眼、不孕不育、動(dòng)脈粥樣硬化、肺炎等。衣原體的致病機(jī)制仍有待探討，最新研究表明衣原體質(zhì)粒蛋白Pgp4調(diào)控的染色體基因與致病性緊密相關(guān)。即使在質(zhì)粒缺失的衣原體毒株如肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體中，這些染色體基因同樣保守存在。這些染色體基因的致病機(jī)理是目前衣原體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究探索了這些染色體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ChxR間的關(guān)聯(lián)。

圖2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的glgA啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)pgsA、glgA、tRNA示衣原體基因的位置和方向；下面的核酸序列標(biāo)注了預(yù)測(cè)的glgA啟動(dòng)子、TSS、RBS（核糖體結(jié)合位點(diǎn)）和TL（翻譯起始位點(diǎn)）

Pgp4調(diào)控染色體基因表達(dá)的機(jī)制和ChxR的功能都還不清楚，我們通過(guò)體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pgp4調(diào)控的4個(gè)染色體基因的上游區(qū)有多個(gè)ChxR結(jié)合位點(diǎn)，提示ChxR參與這些染色體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；通過(guò)鑒定glgA mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和設(shè)計(jì)寡核苷酸探針進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ChxR在glgA轉(zhuǎn)錄中可能起到阻遏蛋白的作用。這些研究提示glgA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能是多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子協(xié)同作用的結(jié)果。

圖4 引物延伸實(shí)驗(yàn)

圖5 寡核苷酸探針oligo1～5與ChxR的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)A：oligo1～5為5條寡核苷酸探針，其中1號(hào)探針緊鄰glgA ORF；B：oligo1～5分別有2、2、1、0和1條阻滯條帶

本研究除了提示ChxR參與質(zhì)粒調(diào)控基因表達(dá)外，重要的是發(fā)現(xiàn)ChxR有廣泛的DNA結(jié)合活性，但我們沒(méi)能找到其識(shí)別結(jié)合的DNA序列特征，很可能有更多的基因受其調(diào)控。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持ChxR可能是全局調(diào)控因子，該蛋白可能同時(shí)為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和抑制子。新出現(xiàn)的衣原體遺傳操作技術(shù)為下一步深入研究ChxR和Pgp4協(xié)同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制提供了重要工具[5,10-13]。

[1] Kari L,Whitmire W M,Olivares-Zavaleta N,et al.A live-at?tenuated chlamydial vaccine protects against trachoma in non?human primates[J].J Exp Med,2011,208(11):2217-2223.

[2] Sigar I M,Schripsema J H,Wang Y,et al.Plasmid deficien?cy in urogenital isolates of Chlamydia trachomatis reduces in?fectivity and virulence in a mouse model[J].Pathog Dis,2014,70(1):61-69.

[3] O'Connell C M,Ingalls R R,Andrews C W Jr,et al.Plas?mid-deficient Chlamydia muridarum fail to induce immune pa?thology and protectagainstoviductdisease[J].JImmunol,2007,179(6):4027-4034.

[4]Carlson J H,Whitmire W M,Crane D D,et al.The Chlamyd?ia trachomatis plasmid is a transcriptional regulator of chromo?somal genes and a virulence factor[J].Infect Immun,2008,76(6):2273-2283.

[5] Song L,Carlson J H,Whitmire W M,et al.Chlamydia tracho?matis plasmid-encoded Pgp4 is a transcriptional regulator of virulence-associated genes[J].Infect Immun,2013,81(3):636-644.

[6] Koo I C,Walthers D,Hefty P S,et al.ChxR is a transcrip?tionalactivatorin Chlamydia[J].ProcNatlAcad SciUSA,2006,103(3):750-755.

[7] Hickey J M,Weldon L,Hefty P S.The atypical OmpR/PhoB response regulator ChxR from Chlamydia trachomatis forms ho?modimers in vivo and binds a direct repeat of nucleotide se?quences[J].J Bacteriol,2011,193(2):389-398.

[8] Hickey J M,Lovell S,Battaile K P,et al.The atypical re?sponse regulatorprotein ChxR hasstructuralcharacteristics and dimer interface interactions that are unique within the OmpR/PhoB subfamily[J].J Biol Chem,2011,286(37):32606-32616.

[9] Barta M L,Hickey J M,Anbanandam A,et al.Atypical re?sponse regulator ChxR from Chlamydia trachomatis is structur?ally poised for DNA binding[J].PLoS One,2014,9(3):e91760.

[10]Wang Y,Kahane S,Cutcliffe L T,et al.Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis:restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vec?tor[J].PLoS Pathog,2011,7(9):e1002258.

[11]Kari L,Goheen M M,Randall L B,et al.Generation of tar?geted Chlamydia trachomatis null mutants[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(17):7189-7193.

[12]Nguyen B D,Valdivia R H.Virulence determinants in the ob?ligate intracellularpathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(4):1263-1268.

[13]Song L,Carlson J H,Zhou B,et al.Plasmid-mediated trans?formation tropism of chlamydial biovars[J].Pathog Dis,2014,70(2):189-193.