鉤端螺旋體層粘連蛋白結(jié)合蛋白Lsa20的表達與功能分析

魏穎，袁盛凌，姚雪晶，陶好霞，王令春，劉純杰，田威，王艷春

1.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

黏附到宿主細胞表面是許多病原微生物感染的必要步驟。病原微生物通過黏附分子，與表達于宿主細胞表面的特定配體分子相互作用而完成對靶細胞的黏附，進而在該部位定居并大量繁殖，產(chǎn)生毒素或侵入細胞內(nèi)部，損傷組織細胞，發(fā)揮致病效應(yīng)[1-3]。在這一過程中，識別黏連基質(zhì)分子的微生物表面成分（microbial surface components recognizing adhe?sive matrix molecules，MSCRAMM）扮演著十分關(guān)鍵的角色[4-6]。在眾多MSCRAMM分子中，層粘連蛋白結(jié)合蛋白（laminin-binding protein，LBP）是其中的一大類，它們主要識別靶細胞表面細胞外基質(zhì)中的糖蛋白——層粘連蛋白（laminin，LN）[3]。以肺炎鏈球菌為例，該菌株通過其表面的MSCRAMM分子PspC與宿主腦微血管上皮細胞表面的LN結(jié)合，然后利用胞吞轉(zhuǎn)運作用模式通過內(nèi)皮屏障，一但進入腦脊液，肺炎鏈球菌迅速繁殖并釋放出大量毒力因子，如脂磷壁酸（LTA）和肺炎鏈球菌溶血素（Ply），進而激活機體內(nèi)相關(guān)的信號通路并引發(fā)機體的炎癥反應(yīng)[7-8]。再如，對寄生蟲構(gòu)端螺旋體而言，其表面表達的Lsa20、Lsa30和Lsa33等LBP能夠與宿主細胞胞外基質(zhì)中的LN結(jié)合，促進其在宿主體內(nèi)的定植，在其致病過程中發(fā)揮重要作用[9]。因此，LBP在病原微生物致病機制研究過程中受到廣泛重視。

我們通過基因工程方法表達并純化了可溶性的重組構(gòu)端螺旋體Lsa20蛋白，并對其與LN相互作用的生物特性進行分析，建立了研究類似生物功能蛋白的相關(guān)技術(shù)方法和手段，為后續(xù)研究和鑒定其他新的LBP奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

COS-7細胞、大腸桿菌表達載體pET-28a為本室保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；用于研究相互作用的蛋白配體鼠源LN購自Singa-Aldrich公司；無蛋白封閉液購自Thermo公司；抗小鼠His-tag單抗、可溶性單組分TMB底物顯色液購自天根生化科技有限公司；兔抗小鼠LN多抗購自Millipore公司；HRP標(biāo)記的二抗購自中杉金橋公司；Ni-NTA His·Bind Resin購自Novagen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2 Lsa20編碼基因的合成

構(gòu)端螺旋體的Las20蛋白編碼基因序列（Gen?Bank ID：2772019）從NCBI網(wǎng)站獲得，序列由金唯智公司合成，合成前利用該公司的密碼子優(yōu)化工具OPTIMWIZ針對大腸桿菌密碼子偏愛性及其他可能提高表達水平的參數(shù)進行優(yōu)化。合成的序列克隆到pUC57質(zhì)粒后測序，鑒定正確的質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

1.3 Lsa20蛋白在大腸桿菌中的表達純化

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切含Lsa20基因的質(zhì)粒，切膠純化回收獲得目標(biāo)基因片段，與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pET28a（+）連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機挑選菌落進行菌落PCR鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），對應(yīng)單位克隆接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再取過夜培養(yǎng)菌液按1∶100的比例接種到含卡那霉素50 μg/mL的400 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16℃過夜誘導(dǎo)表達，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)物于4℃、8000 r/min離心10 min，棄上清，菌體用等體積的PBS洗滌1次，用20 mL PBS重懸菌體，超聲波破碎，離心收集裂解物的上清，制備電泳樣品，用15%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE分析。

吸取2 mL Ni-NTA His·Bind Resin裝于填充柱中，加入5倍柱體積的結(jié)合緩沖液進行柱平衡；用超聲波破碎后的菌液上清重懸親和樹脂，重懸后的混合物置于100 mL燒杯中，燒杯中放入轉(zhuǎn)子，將燒杯固定在冰浴盒中，置于磁力攪拌器上，緩慢攪拌30 min；將攪拌后的混合物重新裝入柱中，液體滴盡后加入50倍柱體積的清洗緩沖液洗滌，洗滌完成后加入2倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫蛋白，對洗脫的蛋白溶液進行SDS-PAGE分析；將洗脫液10 mL置于超濾管中，4℃、5500 r/min離心60 min，再加入PBS溶液使總體積至10 mL，4℃、6000 r/min離心60 min，重復(fù)3次，最后濃縮至2 mL體積；SDSPAGE分析濃縮后的蛋白溶液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA分析Lsa20蛋白與LN的黏附作用

1.4.1 固定LN 用包被液將鼠源LN溶液稀釋至10 μg/mL后加到96孔板中，每孔100 μL，于4℃過夜；棄去板中液體，用洗滌液PBST洗滌96孔板3次；每孔加入無蛋白封閉液200 μL，37℃封閉1 h；用洗滌液PBST洗滌96孔板3次，加入以保溫液倍比稀釋的 Lsa20（濃度依次為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 25、0.0156、0.0078 μmol/L），每孔 100 μL，每個稀釋度各3孔，同時設(shè)定空白對照（不加孵育蛋白，只加保溫液），37℃孵育1 h；用PBST洗板3次，加入抗 His單抗（1∶1000稀釋），每孔 100 μL，置37℃孵育1 h；用PBST洗板3次，用保溫液將HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶5000）稀釋后加入反應(yīng)孔中，每孔100 μL，置37℃孵育1 h；用PBST洗板3次，加入TMB底物顯色液，每孔100 μL，置室溫避光顯色10 min；加入終止液，每孔100 μL，室溫放置5 min；用酶聯(lián)儀測定各孔的D450nm值，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.4.2 固定Lsa20 Lsa20作為固定蛋白，LN作為孵育蛋白，其他步驟與1.4.1基本相同。另外，Lsa20包被濃度為10 μg/mL，每孔100 μL；LN加入濃度依次為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL；一抗為兔抗小鼠LN多抗，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析和曲線擬合 采用GraphPad 5.0軟件進行，方法選擇單一位點結(jié)合曲線（one-site bind?ing hyperbola）。根據(jù)ELISA測定的解離常數(shù)kd，按照下式計算：

其中x為Lsa20蛋白濃度，y為光吸收值，Bmax為由曲線推算的最大光吸收值。

1.5 流式細胞術(shù)分析

傳代培養(yǎng)COS-7細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%融合，EDTA消化后用PBS洗滌重懸細胞，按細胞數(shù)量1×106/管分裝到一定數(shù)量的EP管中，500 r/min離心10 min，棄上清；向EP管中加入終濃度為50 μg/mL的蛋白樣品，重懸細胞，同時直接加入等量PBS作為空白對照，4℃孵育1 h，離心棄上清；向EP管中加入500 μL PBS重懸細胞，離心棄上清，重復(fù)洗滌3次；向洗滌后的細胞中加入抗His單抗，4℃孵育1 h，離心棄上清；向洗滌后的細胞中加入含F(xiàn)ITC標(biāo)簽的山羊抗小鼠二抗，4℃避光孵育1 h，離心棄上清；向每個樣品中加入500 μL PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

1.6 間接免疫熒光分析

取2瓶培養(yǎng)好的COS-7細胞，經(jīng)EDTA消化后，用10 mL PBS將所有細胞重懸，加入提前放置蓋玻片的24孔板內(nèi)，過夜，使細胞長至70%～80%，500 r/min離心10 min，棄上清；每孔加入一定量純化的Lsa20蛋白，并用RPMI-1640培養(yǎng)基定容至1 mL，蛋白濃度為100 μg/mL，同時以未加Lsa20蛋白、僅加培養(yǎng)基（含血清）的孔作為陰性對照，完成加樣后將24孔板在冰上孵育60 min，吸取孔中培養(yǎng)基，細胞用PBS溶液洗3次，每次5 min；加入含4%多聚甲醛的PBS溶液，室溫固定15 min，結(jié)束后用PBS溶液洗3次；加入含3%胎牛血清的PBS溶液500 μL，室溫孵育30 min進行封閉；加入抗His單抗，用細胞培養(yǎng)基1∶200稀釋，室溫孵育60 min；用PBS溶液洗3次，每次5 min；加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，用細胞培養(yǎng)基1∶1000稀釋，室溫孵育30 min；用PBS洗3次，每次5 min；用DAPI對細胞核染色10 min，用PBS洗2次，每次5 min；在載玻片上滴少量的抗萃滅封片劑，小心地將蓋玻片取出，將樣品面朝下，緩慢地將蓋玻片蓋于載玻片上，待抗萃滅封片劑干燥后在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 Lsa20在大腸桿菌中的表達純化

按前述方法構(gòu)建表達Lsa20的重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-Lsa20和對照菌株BL21（DE3）/pET28a，同時以不含質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）作為空白對照，對前2株菌進行IPTG誘導(dǎo)及純化濃縮，分別進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1A。與對照菌株相比，重組菌在相對分子質(zhì)量約23×103處有明顯的特異蛋白表達條帶，與預(yù)期的Lsa20蛋白大小相符。

利用Ni-NTA His·Bind Resin進行純化，收集目的蛋白，經(jīng)Milipore超濾離心管濃縮后進行SDSPAGE分析（圖1B），凝膠成像分析顯示蛋白純度高于90%，用BCA蛋白定量試劑盒定量，濃度為2.0 mg/mL，可用于后續(xù)相互作用實驗。

2.2 間接ELISA分析

用間接ELISA分析在固定條件下目標(biāo)蛋白之間的相互作用。結(jié)果顯示，Lsa20與LN之間有較強的相互作用。當(dāng)LN為固定相時，孵育倍比稀釋的Lsa20蛋白后，吸光度值與濃度形成相應(yīng)的濃度依賴性，當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_1 μmol/L左右時，二者結(jié)合趨于飽和（圖2A）。用GraphPad 5.0軟件分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)，可得出解離常數(shù) kd約為（27.23±2.53） nmol/L。同時，以Lsa20為固定相，孵育濃度倍比稀釋的LN后吸光度值與濃度形成相應(yīng)的濃度依賴性，并于蛋白孵育10 μg/mL LN時趨于飽和（圖2B）。

2.3 流式細胞術(shù)分析

圖1 重組Lsa20蛋白的表達（A）和純化（B）M：蛋白marker；1：BL21（DE3）；2：BL21（DE3）/pET-28a；3：BL21（DE3）/pET-Lsa20；4：超聲波裂解上清；5：穿過峰樣品；6：純化的目標(biāo)蛋白

圖2 ELISA分析Lsa20與LN的相互作用A：LN為固定相；B：Lsa20為固定相

進一步利用流式細胞術(shù)分析細胞表面LN與Lsa20之間的相互作用，結(jié)果如圖3。與用PBS孵育的空白對照相比，Lsa20孵育后熒光信號明顯偏移，這表明Lsa20能夠識別靶細胞表面的LN，且二者之間具有較強的相互作用。

2.4 間接免疫熒光分析

將重組Lsa20與COS-7細胞共孵育，用His-tag單抗進行間接免疫熒光分析。結(jié)果顯示，與只加細胞培養(yǎng)液的對照相比，Lsa20能夠黏附到COS-7細胞表面，具有LN結(jié)合蛋白的特征（圖4）。

圖3 流式細胞術(shù)分析Lsa20蛋白的黏附作用紫色：PBS（空白對照）；綠色：重組Lsa20（樣品峰）

圖4 間接免疫熒光法分析Lsa20的黏附作用A：加入細胞培養(yǎng)液對照；B：加入Lsa20

3 討論

在MSCRAMM的研究中，ELISA、流式細胞術(shù)和間接免疫熒光是最常用的方法[10-12]。這是因為，一方面這幾種方法操作簡單，成本相對較低，易于進行；另一方面，這些方法的結(jié)果相對可靠，使用廣泛，認(rèn)可度較高。另有研究表明，COS-7細胞的細胞外基質(zhì)以LN分子為主，可用于研究LN結(jié)合蛋白的細胞模型[13]。在本研究中，我們同樣是利用這幾種方法，以鉤端螺旋體Lsa20蛋白為研究對象，以COS-7細胞為細胞模型，建立了研究LBP生物學(xué)性質(zhì)的實驗技術(shù)，為后續(xù)研究和鑒定新的該類型蛋白奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

在研究中我們發(fā)現(xiàn)，利用ELISA進行目標(biāo)蛋白與LN相互作用親和力測定實驗時，封閉液對實驗結(jié)果的影響很大，特別是選用常規(guī)的脫脂奶粉進行實驗時背景值相對較高（未附相關(guān)數(shù)據(jù)）。因此，經(jīng)過實驗篩選，最終選擇采用商品化的無蛋白封閉液進行（該封閉液中發(fā)揮作用的是非蛋白類生物分子，一般不會與重組蛋白發(fā)生相互作用），最終取得了較為理想的實驗結(jié)果。

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