鹽酸多西環(huán)素牙周用溫敏凝膠的制備及質量評價

徐 斌

（湖北省武漢市東湖醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430074）

牙周病是由厭氧菌為主混合感染引起的慢性炎性感染性疾病，是導致成年人牙齒喪失的最主要原因。傳統(tǒng)的機械刮療或抗菌藥物全身使用存在治療不徹底、易產生細菌耐藥等弊端［1］，故應采用局部緩釋給藥，減少系統(tǒng)性不良反應，維持和控制藥物釋放的濃度和時間，減少細菌耐藥性的產生［2］。溫敏凝膠是一種以液態(tài)形式注射給藥后，在體溫條件下迅速形成半固態(tài)藥物貯庫的緩釋給藥系統(tǒng)，在方便給藥的同時還延長了藥物在用藥部位的滯留時間，可提高生物利用度［3］，是目前研究較廣泛的原位凝膠之一。鹽酸多西環(huán)素（DXY）是半合成四環(huán)素類廣譜抑菌劑，能有效控制牙周的齦下菌斑，對大多數(shù)牙周病致病菌有明顯的抑制作用［4］。本研究中以DXY為模型藥物，以生物相容性好、可降解的溫敏材料泊洛沙姆P407為緩釋材料制備鹽酸多西環(huán)素溫敏凝膠。凝膠可通過細小鈍針頭注射到牙周袋內，接觸齦溝液后凝固，并與牙周袋內的不規(guī)則形狀很好地貼合，從而持續(xù)穩(wěn)定地釋放藥物，使藥物濃集于牙周袋內，提高藥物療效和生物利用度。

1 儀器與試藥

UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）；S25-2型磁力攪拌器（上海司爾儀器有限公司）；Hakke

RheoStress 6000型旋轉流變儀（德國 Thermo Scientific公司）；SHZ-82型空氣恒溫震蕩器（常州國華電器有限公司）。鹽酸多西環(huán)素（DXY，含量為 99.0%，湖北恒碩化工有限公司，批號為130103019）；泊 洛 沙 姆 407（P407，德 國 BASF 公 司 ，批 號 為50259528）；泊 洛 沙 姆 188（P188，德 國 BASF 公 司 ，批 號 為50259527）；NaH2PO4，Na2HPO4（國藥集團化學設計有限公司，批號分別為20140109，20140130）為分析純，試驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 溫敏凝膠的制備

按照表1處方，采用冷法工藝［5］，在磁力攪拌下依次加入一定量的P188及P407至分散均勻，于4℃冰箱中冷藏24 h，直至聚合物完全溶脹至澄明；然后將適量的DXY加入到聚合物溶液中，攪拌，溶解，即得DXY溫敏凝膠。

2.2 熱力學考察

膠凝溫度（GT）測定：采用試管倒轉法［6］，取 1 mL 空白凝膠，置直徑為1cm的薄壁試管中，將體系放置到10℃水浴中，以1℃ ／min的速率升高水浴溫度，每升高0.5℃，試管倒轉30 s內不流動即為膠凝，此時的溫度為GT。結果表明，GT隨P407濃度增加而降低，但濃度低于15%時無溫敏特性；同一P407濃度時，GT隨P188濃度（＜10%）的增加而升高；DXY的加入對GT無顯著影響。人體正?？谇粶囟葹?6.3～37.2℃，理想的溫敏凝膠應是在體外溫度（25℃）下為流動的液體，在體溫條件下迅速成為半固體，因此考慮GT在33～35℃范圍內。處方組成P407∶P188為16∶1，18.5∶2時符合要求，但16∶1組膠凝后形成的凝膠稍加外力，凝膠即成黏稠的流動狀態(tài)，可塑性差。P407∶P188＝18.5 ∶2組的GT符合要求。

表1 不同凝膠配比對膠凝溫度的影響（n＝3）

膠凝時間測定［7］：取1 mL鹽酸多西環(huán)素溫敏凝膠，置薄壁西林瓶中，室溫下平衡10 min，隨后將西林瓶傾斜60°，放入37℃恒溫水浴中，待凝膠形成的彎月面不流動即為膠凝，記錄膠凝時間。重復上述步驟平行測定3次，取平均值。結果樣品的膠凝時間為（1.2±0.5）min，說明DXY溫敏凝膠注射到牙周袋后能迅速膠凝。

2.3 適針性與通針性考察［8］

取2 mL自制凝膠，采用不同型號的注射針頭，觀察從容器抽入針筒時是否存在堵塞與發(fā)泡現(xiàn)象，如無堵塞與發(fā)泡，說明適針性良好。推動活塞，將制劑從針筒打出，如推動順暢，無阻力，說明通針性良好。凝膠在體外條件下的黏度直接影響注射操作，低黏度有利于適針性與通針性，便于取用和注射，以免操作時間過長，凝膠在給藥過程中膠凝，并可能阻塞針頭。試驗結果表明，鹽酸多西環(huán)素溫敏凝膠在體外環(huán)境下對5 mL注射器23G、25G針頭的適針性與通針性良好，滿足注射劑的臨床使用要求。

2.4 流變學考察［9］

使用Hakke RheoStress 6000型旋轉流變儀，樣品溫度精確控制在±0.1℃內，應變幅度設為1.0%，測定凝膠在25℃和37℃條件下的復數(shù)黏度η*，掃描頻率為0.1～20 Hz。結果DXY溫敏凝膠不同溫度下復數(shù)黏度η*隨剪切速率的變化見圖1。由流變學考察結果可知，體外條件（25℃）下，DXY溫敏凝膠的η*較小，隨剪切速率的增大η*不受影響，說明此時呈牛頓流體特征?？谇粶囟龋?7℃）條件下，η*增大，隨剪切頻率的增大，η*明顯降低，說明37℃時凝膠半固體狀態(tài)已形成，且具有非牛頓流體剪切變稀的假塑性現(xiàn)象。

2.5 體外釋放度測定

測定波長選擇：精密稱取DXY對照品，用pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解并配制成 10 μg／mL 的溶液，于 200 ～400 nm波長范圍內掃描，測定最大吸收波長。取空白凝膠，置釋放裝置中，待2 h后，取釋放介質，0.45 μm微孔濾膜過濾后在200～400 nm波長范圍內掃描，考察有無干擾。由圖2可見，鹽酸多西環(huán)素的最大吸收波長為276 nm，空白凝膠溶液在276 nm波長處無干擾。

標準曲線繪制：精密稱取 DXY對照品10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加入pH＝7.4的PBS溶液溶解并定容，配制成100 μg／mL的貯備液。精密量取貯備液分別配制質量濃度為2，5，10，15，20，25 μg／mL 的系列質量濃度溶液，以 pH ＝7.4 的 PBS溶液為空白，在276 nm波長處測定吸光度（A）值，以質量濃度（ρ）為橫坐標、A值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 A＝0.032 9 ρ-0.002 4（R2＝ 0.999 4）。結果表明，DXY 質量濃度在2～25 μg／mL范圍內與吸光度值線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為 5，10，15 μg ／mL 的標準溶液，測定吸光度，分別于1 d內測定5次，每天測定1次、共測定5 d，計算日內精密度和日間精密度。結果的 RSD分別為0.25%和0.68% （n ＝5），表明儀器精密度良好。

圖2 鹽酸多西環(huán)素和空白凝膠紫外掃描圖

穩(wěn)定性試驗：取質量濃度為10 μg／mL的標準溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 h 內對其吸光度進行測定。結果的 RSD 為0.45%（n＝7），表明標準溶液在12 h內穩(wěn)定。

體外釋放度測定：采用動態(tài)膜透析法［10］，精密稱取溫敏凝膠適量及DXY水溶液，置透析袋中，封口扎緊，置裝有50 mL pH＝7.4的 PBS溶液的離心管中，在（37±0.5）℃空氣恒溫振動器中以100 r／min的轉速震蕩，每隔一定時間取樣1 mL，立即補加等量同質同溫釋放介質1 mL。將所取樣1 mL稀釋至10 mL，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后測定其紫外吸光度值，計算藥物累積釋放量及累積釋放百分率，繪制累積釋放曲線（見圖3）?？梢姡纤幦芤? h即釋放約90%，DXY溫敏凝膠此時釋放了46.3%，在8 h時累積釋放百分率為88%，約12 h基本釋放完全，說明DXY溫敏凝膠具有一定的緩釋作用。

圖3 鹽酸多西環(huán)素溫敏凝膠累積釋放曲線

3 討論

P407及P188是目前研究最多、使用最普遍的溫度敏感材料，具有良好的生物相容性，毒性低［11］。研究表明，其大量使用（15% ～50%）對黏膜無刺激性、無過敏作用，化學性質穩(wěn)定，在體內不會發(fā)生代謝轉化，而被美國食品藥物管理局（FDA）收錄為安全的一類藥用輔料（GRAS）［12］。且泊洛沙姆具有增溶作用［13］，制備溫敏凝膠方法簡便，亦適合于難溶性藥物制備成溫敏凝膠。

欲達到目標溫度，P407及P188的濃度配比可能有多重組合。但如果聚合物的總濃度過低，達到膠凝溫度時塑形性差；聚合物用量過多時，在制備時聚合物溶脹不充分，適針性和通針性不合要求。本試驗中以DXY為模型藥物，P407及P188為溫敏材料制備溫敏凝膠時，以膠凝溫度作為初步篩選指標，結合膠凝時間、適針性與通針性、流變學對處方進一步篩選，通過透析袋法考察體外釋藥特性。結果表明，本制劑在體外條件下流動性好，體溫下能迅速膠凝成半固態(tài)，可塑性好，具有一定的緩釋作用。

此外，由于P407為聚氧乙烯（PEO）和聚氧丙烯（PPO）組成的嵌段共聚物，pH在5～6之間，而牙周患者的口腔pH變化范圍為6～8，因此在制備時不需加入緩沖溶液調節(jié)pH。

參考文獻：

［1］劉慶曉，楊美燕，高春生.牙周局部緩釋給藥系統(tǒng)研究進展［J］.中國新藥雜志，2009，18（23）：2 228-2 232.

［2］張 萍，朱聰惠，裘松波，等.牙周病非手術治療進展［J］.中國藥業(yè)，2008，17（3）：61-63.

［3］項佳音，楊洪軍，熊 欣，等.常見溫度敏感型原位凝膠載體的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，17（2）：252-257.

［4］蘆 潔，祝 林，金鴻萊，等.鹽酸多西環(huán)素脂質體凝膠劑的制備與評價［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（2）：93-95.

［5］吳杏梅.鹽酸格拉司瓊鼻用溫敏型凝膠的制備及體外釋放度研究 ［J］.中國藥業(yè)，2008，17（16）：49.

［6］馬鳳余，胡容峰，徐亞靜.奧洛他定溫度敏感眼用原位凝膠的制備 ［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32（11）：858.

［7］Yang Y，Wang JC，Zhang Q，et al.A novel mixed micelle gelwith thermosensitive property for the local delivery of docetaxel［J］.J Control Release，2009，135（2）：175-182.

［8］汪 姍，劉 宏，宋 青，等.甲磺酸加貝酯溫敏原位凝膠的制備及質量評價［J］.國際藥學研究雜志，2014，41（3）：347-378.

［9］郜琪臻，劉華麗，魏 靜，等.鹽酸米諾環(huán)素原位凝膠的流變學研究［J］.化學與生物工程，2012，29（1）：63-65.

［10］Ma L，Liu M，Liu H，et al.In vitro cytotoxicity and drug release properties of pH-and temperature-sensitive core-shell hydro gel microspheres［J］.Int J Pharm，2010，385（1-2）：86-91.

［11］杜廣增，趙浩如.Poloxamer407溫敏性即型凝膠的制備和應用進展 ［J］.藥學進展，2008，32（4）：163-167.

［12］田 芳，王玉柱，楊 凱，等.尼非韋羅陰道溫敏原位凝膠的流變學研究［J］.中國新藥雜志，2013，22（3）：345-350.

［13］金璐燕，李 娟.泊洛沙姆407在制劑中的應用進展［J］.藥學與臨床研究，2009，17（3）：231-234.