不同栽培類型對紅豆杉中紫杉醇含量的影響

曹云飛，倪慧艷，袁 松，葉 飛，劉寶華

(1.鎮(zhèn)江市藥品檢驗所，江蘇 鎮(zhèn)江 212003;2.鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001;3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100503;4.江蘇大學附屬醫(yī)院細胞治療中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212001;5.山東新華制藥股份有限公司，山東 淄博 255087)

紅豆杉又名紫衫，是一種紅豆杉屬的植物［1］，其主根不明顯、側(cè)根發(fā)達。自美國化學家Wani等從紅豆杉中分離得到紫杉醇以來，紫杉醇以其良好的抗癌活性引發(fā)對紅豆杉的研究熱潮。然而，由于紅豆杉屬植物生長緩慢，自身繁殖率低，紫杉醇在紅豆杉中含量較低，且隨著全球?qū)σ吧t豆杉資源保護措施的不斷加強，利用野生資源生產(chǎn)紫杉醇已無可能。因此，如何解決原料來源問題就成了紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。為滿足日益增長的社會需求，相關(guān)學者進行了多方面的研究:人工栽培、紫杉醇全合成、真菌培養(yǎng)法、器官培養(yǎng)法、組織及細胞培養(yǎng)法等;迄今為止，人工栽培依然被認為是最有效的解決途徑。目前國內(nèi)人工栽培已經(jīng)形成了較大的規(guī)模，并已開始用于紫杉醇的生產(chǎn)。但人工栽培紅豆杉的深入研究尚未見報道，本文建立紫杉醇的高效液相色譜測定方法，對不同栽培類型的紅豆杉中紫杉醇的含量進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀、Chemstation色譜工作站(美國Agilent公司);Cleanert C18SPE固相萃取柱(艾杰爾公司)。

1.2 試藥 紫杉醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110773－201012);超純水自制;甲醇、乙腈為色譜純(國藥集團);其余試劑為分析純。紅豆杉A，紅豆杉B，取紅豆杉樹枝、樹干及樹根經(jīng)速萬能粉碎機粉碎，過1.0 mm樣品篩后備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［2，3］色譜柱:Venusil ASB C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈為流動相 A，以 0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(乙酸調(diào)節(jié)pH為5)為流動相B，按表1進行梯度洗脫;流速為1.0 mL·min－1;紫外檢測波長為227 nm;柱溫為40℃;進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品貯備液制備 精密稱取紫杉醇對照品約10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。另精密稱取紫杉醇對照品約10 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末3 g，用乙酸乙酯－丙酮混合溶液180 mL進行索氏提?。?］，回流8 h，冷卻過夜，收集回流液。將固體物殘留物加入少量提取劑經(jīng)超聲浸提20 min后，并入回流液;回流液于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘留物用少量提取劑轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定溶至刻度。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，用甲醇定溶至刻度。供試品溶液典型色譜圖見圖1。

2.4 標準曲線的制備 分別精密量取對照品貯備液2、4、6、20、50 mL，置200 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為 1、2、3、10、25 μg·mL－1的對照品溶液，照上述色譜條件進樣檢測，測定峰面積值(A)，并以A對濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線，線性關(guān)系［5］考察見表2。結(jié)果表明在1.022～25.55 μg濃度范圍內(nèi)，峰面積與紫杉醇濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程:A=63.199C－561.19，r=0.9987。

圖1 色譜圖

2.5 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液，分別于0、4、8、12 h［6］在上述色譜條件下測定，結(jié)果表明對照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.33%。

2.6 精密度試驗 取對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)測定5次，RSD為0.2%，表明精密度良好。

2.7 重復性試驗 按照擬訂的含量測定方法，取同一棵樹的樹枝粉末［7］，配制供試品溶液，照上述色譜條件下測定，重復進樣5針，RSD為0.1%。

2.8 回收率試驗 平行取9份已知含量的樣品［8］，分別加入紫杉醇 4.09、5.11、6.13 μg，按“2.4”項下所述方法操作，照上述色譜條件下測定，結(jié)果見表3。

表3 回收率測定結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測定 取不同栽培類型的紅豆杉A和紅豆杉B的樹枝、樹干及樹根，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項所述方法進樣檢測，結(jié)果見表4。

表4 樣品的含量測定結(jié)果

3 討論

紫杉醇在紅豆杉中的含量較低，目前文獻報道的野生紅豆杉枝葉中紫杉醇含量約在0.02%左右，而人工栽培紅豆杉枝葉中紫杉醇含量約在0.01%左右，一方面可見人工栽培［9］對紫杉醇含量具有顯著的影響，另一方面不同文獻所報道的提取方式各有差異。另外，建立的紫杉醇的液相色譜測定法具有簡便、快速、結(jié)果準確性高等特點。

從檢測結(jié)果來看，紅豆杉A的樹枝、樹干及樹根中紫杉醇的含量均顯著高于紅豆杉B［10］，就獲得更多紫杉醇的目的來說，說明紅豆杉A的栽培類型(無土栽培)明顯優(yōu)于紅豆杉B的栽培類型(傳統(tǒng)栽培);另外無論是紅豆杉A，還是紅豆杉B，其各部位紫杉醇含量由大到小的順序均依次為樹根、樹干、樹枝，與文獻報道一致。通過本研究為紅豆杉的栽培技術(shù)提供了技術(shù)數(shù)據(jù)支持。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］劉松青，高振同，代青，等.HPLC法測定紅豆杉皮粗提物中紫杉醇的含量［J］.重慶中草藥研究，1999，40:63－64.

［3］何法霖，盧建偉，趙銳，等.HPLC測定加拿大紅豆杉浸膏中紫杉醇的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32(8):753－754.

［4］俞培忠，李幼萍，吳錦霞.紫杉醇的提取分離和檢測方法的研究進展［J］.中國藥學雜志，1996，31(7):6－9.

［5］郭喜軍，榮俊冬，陳禮光，等.紅豆杉繁殖與栽培研究進展［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2007，3(4):250 －257.

［6］柯春婷.福建省南方紅豆杉中紫杉醇和10－DAB含量及其影響因子［D］.福州:福建師范大學，2009.

［7］高山林，朱丹妮，周榮漢.東亞和北美產(chǎn)紅豆杉屬七種植物中紫杉醇及短葉醇的含量［J］.中國藥科大學學報，1995，26(1):8 －10.

［8］張鋼民，張濤，楊文利.紅豆杉屬植物的研究進展［J］.河北農(nóng)業(yè)大學學報，1998，21(4):104 －108.

［9］李華，李明，鄭志堅，等.超臨界CO2流體萃取法提取紫杉醇的研究［J］.復旦學報(自然科學版)，2003，42(3):453－456.

［10］張艷平，劉同祥.高效液相色譜法測定東北紅豆杉愈傷組織中紫杉醇的含量［J］.貴陽中醫(yī)學院學報，2009，31(6):81－82.