酶聯(lián)免疫法與中和實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)破傷風(fēng)抗體效價(jià)

李榮貞，趙 軍，李慶英，蘇文萍，官 靜，趙玉美，蘇甜甜

(1.山東省生物制品研究所，山東 泰安 271000;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000)

在破傷風(fēng)人免疫球蛋白的生產(chǎn)中，對(duì)半成品及成品的破傷風(fēng)抗體效價(jià)檢測(cè)，通常采用中和實(shí)驗(yàn)法(SNT)［1］。該法耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)要求高、影響因素多、重復(fù)性差。據(jù)報(bào)道［2～5］，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定破傷風(fēng)抗體效價(jià)，迅速、靈敏度高、重復(fù)性好、與SNT法測(cè)定的結(jié)果密切相關(guān)［6］，且操作簡(jiǎn)單。本文旨在對(duì)比SNT法與ELISA法測(cè)定破傷風(fēng)抗體效價(jià)的結(jié)果，通過對(duì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析［7］，證明ELISA法測(cè)定破傷風(fēng)抗體效價(jià)的可行性。

1 材料

標(biāo)準(zhǔn)破傷風(fēng)毒素(中國生物制品檢定研究院，批號(hào):15#，1L+2 mg·mL－1);人源破傷風(fēng)免疫球蛋白效價(jià)國家標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定研究院，批號(hào):001，10 IU/支);破傷風(fēng)抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(泰安京泰生物技術(shù)有限公司，共10批);供試品:破傷風(fēng)人免疫球蛋白(山東泰邦生物制品有限公司共10批);17～19 g SPF級(jí)昆明小鼠(質(zhì)控中心動(dòng)物室);352型多功能酶標(biāo)儀［熱電(上海)儀器有限公司］。

2 方法

2.1 SNT法

2.1.1 破傷風(fēng)抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 先預(yù)稀釋至4.0 IU·mL－1，貯存于2～8℃?zhèn)溆?，臨用時(shí)用硼酸鹽緩沖鹽水稀釋至0.5 IU·mL－1。

2.1.2 供試品溶液的制備 將供試品稀釋成5個(gè)稀釋度，各稀釋度之間間隔約為5%，每mL含抗毒素約0.5 IU。

2.1.3 操作 準(zhǔn)確吸取1 mL工作標(biāo)準(zhǔn)抗毒素及不同稀釋度的供試品溶液，分別加入棕色小試管中，每管加入等量的實(shí)驗(yàn)毒素［5個(gè)試驗(yàn)量(L+/10)·mL－1］，混合均勻，加塞，37℃結(jié)合1 h。準(zhǔn)確注射0.4 mL于小鼠腹部(昆明小鼠，SPF級(jí)，17～19 g)，標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的每個(gè)稀釋度各注射3只，連續(xù)觀察5 d，供試品效價(jià)為與對(duì)照小鼠同時(shí)死亡或出現(xiàn)破傷風(fēng)神經(jīng)毒癥狀最重的最高稀釋度判定。

2.2 ELISA法［8，9］以試劑盒中的樣品稀釋液分別稀釋試劑盒攜帶標(biāo)準(zhǔn)品、供試品與國家標(biāo)準(zhǔn)品，并用破傷風(fēng)人免疫球蛋白(批號(hào):T201201，125 IU·mL－1)做質(zhì)控樣品。

樣品稀釋倍數(shù)的確定:樣品的SNT法所測(cè)定的破傷風(fēng)抗體效價(jià)均在120 IU·mL－1以上，試劑盒的線性范圍在0.125～1 IU·mL－1之間，所以將質(zhì)控品和供試品稀釋至試劑盒的線性范圍之內(nèi)，最終確定樣品稀釋從1∶120到1∶480之間線性最好。

樣品ELISA法效價(jià)的測(cè)定和計(jì)算:將國家標(biāo)準(zhǔn)品(10 IU/支)稀釋至 1.0、0.5、0.25、0.125 IU·mL－1作為標(biāo)準(zhǔn)系列，供試品稀釋至1∶120到1∶480之間。系列稀釋的樣品分別加到酶標(biāo)板孔中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔。按試劑盒說明書操作完成實(shí)驗(yàn)。以國家標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A450值做雙對(duì)數(shù)曲線，(R2≥0.98試驗(yàn)成立)，建立線性回歸方程，將不同稀釋倍數(shù)的供試品稀釋液A450值的對(duì)數(shù)值帶入回歸方程，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出供試品破傷風(fēng)抗體效價(jià)。

3 結(jié)果

3.1 分別利用SNT法和ELISA法對(duì)10批供試品的破傷風(fēng)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，再用ELISA法對(duì)這10批供試品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，均帶質(zhì)控樣品(批號(hào):T201201，破傷風(fēng)抗體效價(jià):SNT法測(cè)得的破傷風(fēng)抗體效價(jià)為125 IU·mL－1)，所測(cè)數(shù)據(jù)如表1所示，對(duì)表1數(shù)據(jù)在Excel中進(jìn)行分析，可知，ELISA法測(cè)得的質(zhì)控品破傷風(fēng)抗體效價(jià)算術(shù)平均數(shù)(ˉx)為128 IU·mL－1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3%。SNT法所測(cè)10批供試品破傷風(fēng)抗體效價(jià)算術(shù)平均數(shù)(ˉx)為126 IU·mL－1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為 5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4%，ELISA法所測(cè)10批供試品破傷風(fēng)抗體效價(jià)算術(shù)平均數(shù)(ˉx)為130 IU·mL－1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的RSD值均小于10%，結(jié)果均準(zhǔn)確可靠。對(duì)表1中數(shù)據(jù)在Excel中利用統(tǒng)計(jì)函數(shù)CORREL分析得知:SNT法和ELSIA法檢測(cè)10批破傷風(fēng)人免疫球蛋白樣品的破傷風(fēng)抗體效價(jià)值，相關(guān)系數(shù)為0.91，說明兩種方法相關(guān)性非常高。

3.2 利用不同批號(hào)的ELISA試劑盒分別對(duì)同一批號(hào)的國家標(biāo)準(zhǔn)品(GB)，質(zhì)控品及供試品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，對(duì)表2數(shù)據(jù)在Excel中進(jìn)行分析，得知不同批號(hào)的ELISA試劑盒測(cè)得的國家標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):001)的破傷風(fēng)抗體效價(jià)回收率均在96%～102%之間，結(jié)果穩(wěn)定可靠。不同批號(hào)的ELISA試劑盒測(cè)得的質(zhì)控品(批號(hào):T201201)的破傷風(fēng)抗體效價(jià)算數(shù)平均數(shù)(ˉx)為127 IU·mL－1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2%;不同批號(hào)的ELISA試劑盒測(cè)得的同一批供試品(批號(hào):T201303)的破傷風(fēng)抗體效價(jià)算術(shù)平均數(shù)(ˉx)為124 IV·mL－1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為 4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4%。由上述數(shù)據(jù)可知，檢測(cè)結(jié)果的RSD值均小于10%，檢測(cè)結(jié)果均準(zhǔn)確可靠。說明該實(shí)驗(yàn)所用的ELISA試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，質(zhì)量可靠，可用于成品及半成品的檢測(cè)。

表1 破傷風(fēng)人免疫球蛋白破傷風(fēng)抗體效價(jià)SNT法與ELISA法檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

表2 不同批號(hào)的破傷風(fēng)抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒所測(cè)破傷風(fēng)抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

4 討論

表2數(shù)據(jù)顯示，用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的國家標(biāo)準(zhǔn)品回收率均在96%～102%之間，說明國家標(biāo)準(zhǔn)品與試劑盒所帶標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果無顯著性差異，初步說明試劑盒質(zhì)量符合規(guī)定要求。表1數(shù)據(jù)顯示SNT法與ELISA法所測(cè)結(jié)果，無明顯差別，且兩種方法檢測(cè)結(jié)果的RSD值均小于10%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均準(zhǔn)確可靠。但是，SNT法測(cè)抗體效價(jià)需要有完善的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室、大量的小白鼠，而且檢測(cè)結(jié)果影響因素多，周期長(zhǎng)達(dá)5 d，操作繁瑣［10］，而ELISA 法迅速、靈敏度高、重復(fù)性好、與SNT法測(cè)定的結(jié)果密切相關(guān)，操作簡(jiǎn)單。說明ELISA法可用于破傷風(fēng)人免疫球蛋白中間過程的效價(jià)監(jiān)控及作為SNT法的輔助方法。

ELISA法應(yīng)注意的問題是:①選擇質(zhì)量穩(wěn)定的試劑盒并嚴(yán)格按照說明書規(guī)范操作;②每次更換新批號(hào)的試劑盒前應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)品(回收率95%～105%)考核試劑盒的質(zhì)量;③每次試驗(yàn)都至少做2個(gè)平行，每次實(shí)驗(yàn)都帶質(zhì)控;④若試劑盒中洗滌液內(nèi)有鹽析現(xiàn)象，將洗滌液充分振蕩溶解，混勻后再做稀釋;⑤加樣應(yīng)準(zhǔn)確，且在反應(yīng)孔內(nèi)混勻，因?yàn)榭乖坏氖欠磻?yīng)孔的表面;⑥在洗滌過程中，拍板的幅度要小，最好甩干，因?yàn)榭乖c抗體的結(jié)合并不牢固，振動(dòng)幅度太大，會(huì)使抗原抗體結(jié)合鏈斷裂，引起花板現(xiàn)象。

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