乙型肝炎標(biāo)志物檢測(cè)誤差分析

摘要：目的 通過(guò)ELISA法檢測(cè)乙型肝炎標(biāo)志物過(guò)程中常見(jiàn)誤差的分析，了解這些因素會(huì)造成的結(jié)果，及其處理方法，為臨床診斷提供真實(shí)可靠的依據(jù)。方法 酶聯(lián)免疫酶標(biāo)法（ELISA法），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。結(jié)果 造成檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的因素是多樣的，其中最主要的影響因素是實(shí)驗(yàn)室操作，試劑，檢驗(yàn)方法。結(jié)論 乙肝標(biāo)志物酶法檢測(cè)時(shí)要排除各種影響因素的干擾，盡量杜絕出現(xiàn)誤差結(jié)果，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎標(biāo)志物檢測(cè)；誤差

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性疾病[1，2]。我國(guó)是乙型肝炎病毒感染的高流行區(qū)。酶聯(lián)免疫酶標(biāo)法（ELISA法）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，盡管當(dāng)前乙型肝炎標(biāo)志物的檢測(cè)新技術(shù)如化學(xué)發(fā)光法、聚合酶鏈反應(yīng)、時(shí)間分辨免疫熒光法及電化學(xué)發(fā)光法等被不斷建立、應(yīng)用，ELISA因其實(shí)用、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且敏感度較高，被用為檢測(cè)乙肝血清標(biāo)志物的首選方法。但是其影響因素較多，在臨床工作中，常常出現(xiàn)誤差。

1 標(biāo)本因素

1.1標(biāo)本需認(rèn)真核對(duì)患者信息，采集標(biāo)本最好是真空速凝采血管。如果使用塑料管，因?yàn)樗芰瞎苣芪娇乖镔|(zhì)，標(biāo)本放置過(guò)久會(huì)使抗原含量降低，造成假陰性。

1.2采集標(biāo)本后分離血清的時(shí)間要控制好，如果在血液尚未開(kāi)始凝固時(shí)便強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白，在ELISA法檢測(cè)過(guò)程中易造成假陽(yáng)性的結(jié)果。分離血清后要及時(shí)檢測(cè)，避免溶血。在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，不敢保證保存過(guò)程中是否受到細(xì)菌污染，而產(chǎn)生非特異顯色，導(dǎo)致本底深而出現(xiàn)假陽(yáng)性。

1.3出現(xiàn)嚴(yán)重溶血的標(biāo)本時(shí)，反應(yīng)孔對(duì)血紅蛋白有非特異性吸附作用，細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)入造成對(duì)血清的稀釋作用，所以輕度溶血也會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。

2 試劑的影響

試劑質(zhì)量是影響檢測(cè)結(jié)果的直接因素，不同廠家的試劑，其靈敏度和特異性也存在一定的差異，其抗原抗體純度、抗體的滴度、親和力和特異性對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生直接影響，另外試劑應(yīng)該用冰箱保存，使用前必須放置至室溫且最好1w內(nèi)用完。

3 操作因素

3.1首先要使用一次性加樣吸頭，避免污染并定期校正加樣器，先將試劑盒從冰箱取出，置室溫平衡20min后使用，試劑用完及時(shí)放回冰箱冷藏。另外加樣過(guò)程中一定要垂直加入準(zhǔn)確量的血清。避免出現(xiàn)加錯(cuò)孔或把血清或酶噴濺到反應(yīng)孔外，造成污染。注意勿觸及包被板底部，以免擦傷包被物，使抗體（抗原）脫落而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度的要求很嚴(yán)格，一般ELISA檢測(cè)乙肝五項(xiàng)的放置的溫度為37℃。溫度高于45℃易引起失活及標(biāo)記物脫落，溫度低于4 ℃，則影響反應(yīng)速度。干浴與水浴有明顯差異，盡可能使用水浴，井將固相板放入水中，使其受熱均勻要貼上密封膜，防止污物侵入。

3.3 ELISA法的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是洗板。首先是加樣后放置一定時(shí)間后洗板，洗滌液的濃度一定要嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)配制，濃度過(guò)小就有可能使陰性標(biāo)本出現(xiàn)假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，最佳洗板次數(shù)為7次，否則有可能出現(xiàn)大量假陽(yáng)性結(jié)果。洗板液泡板時(shí)間過(guò)短，也會(huì)造成大量假陽(yáng)性結(jié)果。因此，洗板時(shí)不能急于將洗滌液從板孔中倒掉，而要將洗滌液在孔中停留一段時(shí)間，這樣就能洗得更干凈，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。手工洗板一次把反應(yīng)孔內(nèi)的纖維蛋白凝塊洗掉以免堵塞洗板機(jī)。洗板時(shí)要注意每孔注滿，且不能讓洗液溢出反應(yīng)孔，否則造成相互污染，板上的殘液沒(méi)有拍干凈，也會(huì)影響檢測(cè)的陰性標(biāo)本，使其出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外洗板機(jī)要定期清洗，以免長(zhǎng)細(xì)菌降低洗板質(zhì)量。

4 結(jié)果判定

ELISA法最早是根據(jù)肉眼觀察顯色的深淺判定結(jié)果，存在一定的客觀性，所以現(xiàn)在在部分醫(yī)院現(xiàn)在都運(yùn)用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)，才能確保結(jié)果的一致性。酶標(biāo)儀也要定期進(jìn)行檢測(cè)①陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照OD值分析：注意試驗(yàn)設(shè)定的陰、陽(yáng)對(duì)照及空白孔的吸光度是否在設(shè)定的有效范圍內(nèi)，因?yàn)橛纱擞?jì)算出來(lái)的Cutoff值將直接影響到樣本陰、陽(yáng)性的判讀；②質(zhì)控品的分析：調(diào)出乙肝質(zhì)控圖分析測(cè)得的數(shù)據(jù)是否在控。若為失控應(yīng)積極配合質(zhì)量控制小組分析失控原因，評(píng)估本次試驗(yàn)的可信度以及是否可以發(fā)報(bào)告；③酶標(biāo)儀判讀要與肉眼判讀進(jìn)行比對(duì)，儀器亦存在偶然的誤差，儀器判讀還是要與肉眼觀察相配合，才能得出正確的檢測(cè)結(jié)果。

5 其它干擾因素

5.1鉤狀效應(yīng)指的是隨著被測(cè)物濃度的增高顯色反而減弱甚至不顯色，這是由于固相抗體只結(jié)合一定量的抗原，在抗原濃度過(guò)高時(shí)，抗體被過(guò)量抗原飽和，不能結(jié)合固相抗體，而導(dǎo)致假陰性。

5.2干擾物質(zhì)的影響 根據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有40%的人血清中含有特異性干擾物質(zhì)。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig.抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等.可采用56℃ 30min滅活補(bǔ)體來(lái)降低假陽(yáng)性的檢出率。

5.3一些藥物會(huì)影響乙肝ELISA法檢測(cè)，如高效價(jià)的免疫球蛋白與乙肝表面抗原形成復(fù)合物，影響乙肝表面抗原的檢出。用0.5M的鹽酸處理標(biāo)本1h，可提高陽(yáng)性檢出率。另外，為了預(yù)防乙肝，部分乙肝表面抗原陰性的人群在接種乙肝疫苗后的1～2w內(nèi)，血清中可以檢出乙肝表面抗原的成分，形成一過(guò)性的乙肝表面抗原陽(yáng)性。所以，建議人們?cè)诮臃N過(guò)乙肝疫苗后1個(gè)月內(nèi)不再做乙肝表面抗原的檢測(cè)。

綜上所述，盡管ELISA法操作簡(jiǎn)單，但可能影響測(cè)定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過(guò)程中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須規(guī)范、仔細(xì)的操作，同時(shí)作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測(cè)每一份標(biāo)木，才能保證檢測(cè)質(zhì)量。盡量避免或減少人為干擾因素對(duì)結(jié)果的影響，，協(xié)助臨床，報(bào)出更準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]王璐.ELISA法檢驗(yàn)乙肝標(biāo)志物影響因素的探討[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2012（4）.

[2]彭俊云.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISE）常見(jiàn)問(wèn)題的原因分析與處理辦法[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2008，5（15）：118-120.

編輯/哈濤