羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測人附睪蛋白4（HE4）的性能驗(yàn)證

摘要：目的 驗(yàn)證和評價羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測系統(tǒng)人附睪蛋白4項(xiàng)目的分析性能。方法 參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）系列文件和相關(guān)文獻(xiàn)，對羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)測定血清人附睪蛋白4（HE4）的精密度、準(zhǔn)確度、分析靈敏度、分析測量范圍、生物參考區(qū)間5大分析性能進(jìn)行驗(yàn)證和評價，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與廠商聲明的性能或公認(rèn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。結(jié)果 測定均值為100.66pmol/L的質(zhì)控樣本，驗(yàn)證后S批內(nèi)為0.827 ，S總為1.679；測定均值為1296.60pmol/L的質(zhì)控樣本，驗(yàn)證后S批內(nèi)為6.077，S總為5.596 。S批內(nèi)≤1/4TEa，S總≤1/3TEa（CLIA'88）。準(zhǔn)確度在±1%以內(nèi)，低于衛(wèi)生部允許的偏差范圍；分析靈敏度<5 pmol/L；線性范圍為60.65pmol/L～1364.50 pmol/L；生物參考區(qū)間在0.00pmol/L～104.00 pmol/L， 均與廠商提供的參數(shù)接近。結(jié)論 羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光檢測HE4的主要分析性能均與廠商聲明一致。本系統(tǒng)檢測性能符合CAP要求。

關(guān)鍵詞：全自動免疫分析儀；性能驗(yàn)證；人附睪蛋白4

為規(guī)范醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作，提高檢驗(yàn)質(zhì)量，美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2003年頒布了《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求》（ISO15189）作為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)要求申請認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對設(shè)備、檢測系統(tǒng)或方法的主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)，證實(shí)其能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。按照ISO15189，以及美國頒布的《臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案》（Clinical Laboratory Improvement Amendments 88，CLIA'88）、美國病理家學(xué)會（College of Ameriean Pathologists ，CAP）的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)，在開展某一檢測項(xiàng)目前，需提供并保留相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。我國2006年頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》要求，對未開展室間質(zhì)評的檢驗(yàn)項(xiàng)目，臨床實(shí)驗(yàn)室必須對檢測系統(tǒng)的分析性能進(jìn)行評價，才可將分析系統(tǒng)用于常規(guī)工作。但如何合理選擇、系統(tǒng)設(shè)計(jì)定量檢驗(yàn)項(xiàng)目方法學(xué)性能驗(yàn)證方案和實(shí)驗(yàn)方法，國內(nèi)報(bào)道甚少。我們參照CLSI指南文件，探討臨床電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清人附睪蛋白4的方法學(xué)性能驗(yàn)證方案和實(shí)驗(yàn)方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年3月門診體檢者新鮮血清（樣本無溶血、無黃疸、無脂血），混合后分裝冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 德國Roche公司Cobas 6000全自動生化免疫分析模組中e601全自動免疫檢測模塊。所用試劑為儀器原裝配套試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品。

1.3 方法 按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)x器進(jìn)行常規(guī)保養(yǎng)和維護(hù)，每天進(jìn)行常規(guī)質(zhì)控（2個濃度水平），質(zhì)控在控后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.1 精密度驗(yàn)證 參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)組織（CLSI）EP5-A2文件，選取2個水平的質(zhì)控血清作為批內(nèi)和批間精密度的待測標(biāo)本，連續(xù)檢測20次，對HE4的精密度進(jìn)行驗(yàn)證。通過實(shí)驗(yàn)得到估計(jì)的批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（S批內(nèi)）和總的標(biāo)準(zhǔn)差（S總）。并與廠家聲明的不精密度進(jìn)行比較。根據(jù)CLIA'88要求，批內(nèi)精密度應(yīng)≤1/4TEa，總精密度應(yīng)≤1/3TEa。驗(yàn)證值得計(jì)算方法如下：

批內(nèi)精密度估計(jì)值的計(jì)算

求出均值： x=∑Xi/n

使用下列公式計(jì)算出批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差估計(jì)值的標(biāo)準(zhǔn)差

Sr=■

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證驗(yàn)證 參考CLSI EP5-A2文件，先用HE4校準(zhǔn)品（Lot：168118濃度分別為：4.1pmol/L、196.0pmol/L）對檢測系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)；再用校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，對各自檢測結(jié)果與靶值進(jìn)行比對，計(jì)算檢測值與靶值的相對偏倚，計(jì)算公式：Bias=（測定值-靶值）/×靶值%

1.3.3 分析靈敏度驗(yàn)證 用去離子水作為零校準(zhǔn)品連續(xù)測定20次，取其平均值，以 x±2s為檢測項(xiàng)目的靈敏度。

1.3.4 分析測量范圍驗(yàn)證 參考CLSI EP6-A3文件，分別收集HE4濃度接近廠商聲明的線性范圍下限和上限的低值樣本（L）和高值樣本（H），按L、0.75L+0.25H、0.5L+0.5H、0.25L+0.75H、H混合，配制成系列濃度實(shí)驗(yàn)樣本，每個濃度重復(fù)測量2次。在重復(fù)測量誤差符合實(shí)驗(yàn)要求的條件下，數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件上進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，判斷實(shí)驗(yàn)所涉及的濃度范圍內(nèi)是否為線性。當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為非線性時，計(jì)算線性偏離。若每個濃度點(diǎn)的線性偏離小于線性允許誤差，則實(shí)驗(yàn)所涉及的濃度范圍即為線性范圍。本研究設(shè)定重復(fù)誤差≤5%，線性偏差≤10%為可接受的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 采集在本院體檢者（血液生化、心電圖和B超檢測均正常）空腹血清，按標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行檢測，要求20個檢測數(shù)據(jù)只允許10%數(shù)據(jù)在給定的生物參考區(qū)間之外，否則需要進(jìn)行檢測項(xiàng)目的生物參考區(qū)間建立。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果 Roche公司聲明的Cobas e601電化學(xué)發(fā)光法檢測HE4的批內(nèi)精密度為3%，總精密度為6%，因?yàn)镾批內(nèi)≤2/3S總，故每天分析低高兩個水平的室內(nèi)質(zhì)控品，每個濃度重復(fù)測定4次，連續(xù)5d（見表1、2）。

對L測定均值為100.66pmol/L，廠商聲明的S批內(nèi)<2.28pmol/L ， S總<3.95pmol/L；驗(yàn)證的S批內(nèi)=0.827pmol/L，S總=1.679pmol/L。批內(nèi)不精密度0.82%，總不精密度1.67%，符合性能要求。

對H測定均值為1296.60pmol/L，廠商聲明的S批內(nèi)<26.90pmol/L， S總<44.90pmol/L；驗(yàn)證的S批內(nèi)=6.077pmol/L，S總=5.596pmol/L。批內(nèi)不精密度0.47%，總不精密度0.43%，符合性能要求。

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果 與標(biāo)準(zhǔn)品比較，本次實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果的相對偏差（SE%）為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受（見表3）。

2.3 分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果 將去離子水作為零標(biāo)準(zhǔn)品檢測HE4 20次，結(jié)果均<5 pmol/L，與廠商提供試劑盒參數(shù)相符合。

2.4 分析測量范圍驗(yàn)證結(jié)果 對系列濃度樣本檢測結(jié)果和預(yù)期值進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)，預(yù)期值為X，實(shí)測值為Y，得直線方程Y=bX+a，即Y=1.0085-12.836，相關(guān)系數(shù)為0.9995>0.975，線性理想。實(shí)測線性范圍60.65pmol/L～1364.50 pmol/L；試劑盒線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L，符合性能要求（見表4）。

2.5 生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 Roche公司提供的參考區(qū)間為0.00pmol/L～104.00 pmol/L ，20個健康人血清標(biāo)本濃度范圍32.04pmol/L～67.05 pmol/L，驗(yàn)證結(jié)果均在儀器說明的參考區(qū)間內(nèi)，提示該95%生物參考區(qū)間可以接受。

3 討論

人附睪上皮分泌蛋白4（human epididymis protein，HE4）是近年來研究較熱門的一種新型腫瘤標(biāo)志物，并擬在中國臨床上推廣應(yīng)用。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心（WFDC）蛋白家族[1]，具有疑似胰蛋白酶抑制劑的特性。此家族中的其它蛋白還包括SLPI，Elafin和PS20（WFDC1）。HE4基因編碼一段長度為13kD的蛋白，包括含有兩個WFDC結(jié)構(gòu)域的一條單鏈[2]。卵巢癌是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡中的第四大常見原因，分泌型HE4在卵巢癌患者的血清中有高水平表達(dá)[3]，HE4檢測用于監(jiān)測上皮卵巢癌疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展。HE4結(jié)合CA125檢測還可進(jìn)一步用于評估存在盆腔腫瘤的停經(jīng)前和絕經(jīng)后女性罹患卵巢癌的風(fēng)險[4]。

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可是目前檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)界討論和關(guān)注的熱點(diǎn)。一個檢測系統(tǒng)的分析性能能夠滿足臨床的要求是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證和\"檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)\"得基本保證。根據(jù)CLIA'88、ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、衛(wèi)生部《三級綜合醫(yī)院評審標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則》、《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科管理規(guī)范》等文件的要求，凡檢測系統(tǒng)在用于臨床之前，必須對其主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，包括精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、分析靈敏度和生物參考區(qū)間等指標(biāo)，證實(shí)其能夠達(dá)到臨床檢測所要求的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

Roche Cobas E601電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光之后發(fā)展起來的新一代的更靈敏、更準(zhǔn)確的小分子標(biāo)記免疫分析技術(shù)，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法，無論是靈敏度、準(zhǔn)確性、精密度均優(yōu)于放射免疫分析法和ELISA，并且克服了前帶、倒鉤等假陰性現(xiàn)象。本研究對Roche Cobas E601電化學(xué)發(fā)光儀檢測系統(tǒng)測定血清HE4的分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，為該項(xiàng)目在本院的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為臨床化學(xué)發(fā)光免疫檢驗(yàn)的方法學(xué)性能驗(yàn)證提供簡便易行的方案和實(shí)驗(yàn)方法。

檢驗(yàn)結(jié)果必須要有好的精密度，也即是好的重復(fù)性。如果沒有良好的重復(fù)性，準(zhǔn)確性就無從談起[6]。該HE4項(xiàng)目測定均值為100.66pmol/L的質(zhì)控樣本，驗(yàn)證后S批內(nèi)為0.827pmol/L，S總為1.679pmol/L，批內(nèi)不精密度0.82%，總不精密度1.67%，符合廠商聲明；測定均值為1296.60pmol/L的質(zhì)控樣本，驗(yàn)證后S批內(nèi)為6.077pmol/L，S總為5.596pmol/L，批內(nèi)不精密度0.47%，總不精密度0.43%，符合廠商聲明。S批內(nèi)≤1/4TEa，S總≤1/3TEa（CLIA'88），可認(rèn)為HE4項(xiàng)目精密度驗(yàn)證通過。準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果的SE%為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88 TEa，即認(rèn)為該儀器測定HE4的準(zhǔn)確度驗(yàn)證通過，滿足臨床需求，并可進(jìn)行其他方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HE4的分析測量范圍在60.65pmol/L～1364.50 pmol/L，與廠商提供線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L略有差異，原因可能是[7]：①樣本選擇的局限，樣本濃度范圍不夠?qū)挘虎谂R床實(shí)驗(yàn)室條件和廠家檢測條件存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)得出的分析測量范圍與廠家略有不同。20個健康人血清標(biāo)本濃度范圍在32.04pmol/L～67.05 pmol/L，驗(yàn)證結(jié)果均在儀器說明的參考區(qū)間內(nèi)，提示該95%生物參考區(qū)間可以接受。按照CLSI C28-A的要求，可直接使用廠商提供的參考區(qū)間。

本研究表明羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測血清HE4的驗(yàn)證結(jié)果與廠商提供的分析性能基本一致，為臨床應(yīng)用該項(xiàng)目提供了詳實(shí)、準(zhǔn)確、可靠地依據(jù)，對規(guī)范電化學(xué)發(fā)光免疫檢驗(yàn)，提高檢驗(yàn)質(zhì)量具有重要意義。

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編輯/成森