23個Y—SNPs遺傳標(biāo)記復(fù)合檢測體系的建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究

摘要：目的 通過建立23-plex Y-SNPs遺傳標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測體系，研究該檢測體系在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價值。方法 選擇Y染色體單體群命名上的23個Y-SNPs位點(diǎn)，建立23-plex Y-SNPs復(fù)合PCR擴(kuò)增體系，利用熒光標(biāo)記單堿基延伸技術(shù)和毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)對單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，調(diào)查290名重慶地區(qū)漢族無親緣關(guān)系的男性個體。結(jié)果 23個Y-SNPs位點(diǎn)均具有遺傳多態(tài)性，每個位點(diǎn)基因的多樣性范圍為0.0137～0.4912。檢測的290名男性個體中有11種單體群、143種單倍型，其單倍型多樣性為0.9907。結(jié)論 23-plex Y-SNPs遺傳標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測體系能靈敏快速準(zhǔn)確地檢測樣本，在法醫(yī)學(xué)研究中有較高的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：Y染色體；單核苷酸多態(tài)性；復(fù)合PCR擴(kuò)增檢測體系；法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

Y染色體具有男性伴性遺傳特性，呈單倍型向下遺傳，在減數(shù)分裂中不發(fā)生重組，一般由父親直接傳給兒子。在個人識別方面，由于Y染色體SNPs非隨機(jī)分布于人群中，其種群的地域性特異明顯，所以可以用于案件中生物學(xué)所屬群體的推斷。尤其在強(qiáng)奸案、輪奸案中分析男女DNA混合物時，Y染色體遺傳標(biāo)記擴(kuò)增分型技術(shù)對單倍型檢測結(jié)果的獲得不受女性成分影響，具有其他遺傳標(biāo)記所沒有的明顯優(yōu)勢。因此，23-plex Y-SNPs遺傳標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測體系在法醫(yī)學(xué)上具有潛在的特殊價值。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器 ①PCR擴(kuò)增儀：480型、9600型、9700型（Applied Biosystem，美國）；②定量PCR儀：ABI PRISM7500（Applied Biosystem，美國）；③電脈儀：Bio-RAD公司（美國）；④DNA全自動遺傳分析儀：Prism 310、Prism 3130-XL（Applied Biosystem，美國）；⑤高速臺式離心機(jī)：ZKl5、ZK3（Sigma，美國）；⑥超純水儀：Millipore（法國）。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 ①SNaPshot試劑盒（Applied Biosystem，美國）；②ExoSAP-IT（USB公司，美國）；③蝦堿性磷酸酶SAP（Amersham公司，美國）；④dNTPs混合物（Fermentas，MBI公司，立陶宛）；⑤Amp FL STR Profiler YfilerTM試劑盒（Applied Biosystem，美國）；⑥Quantifiler human DNA quantification試劑盒（Applied Biosystem，美國）。

1.3實(shí)驗(yàn)樣本及其DNA的提取和定量 在公安部物證鑒定中心隨機(jī)抽取290名廣東地區(qū)漢族無親緣關(guān)系的男性個體，使用采血卡或中性濾紙收集他們的指尖血，編號1-290，采用DNAIQTM（Promega公司，美國）試劑盒進(jìn)行DNA提取，并且采用Quantifiler TM試劑盒（Applied Biosystem，美國）在ABI PRISM7500定量PCR儀上進(jìn)行定量，4℃妥善保存，以備Y-SNPs擴(kuò)增體系的建立和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。

1.4 Y-SNPs遺傳標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

1.4.1 Y-SNPs位點(diǎn)的選擇 根據(jù)Y染色體命名協(xié)會的在線補(bǔ)充材料，參考Y-SNPs信息的在線網(wǎng)站和dbSNP數(shù)據(jù)庫信息，在亞洲人群中篩選出多態(tài)性較高的單體群以及對應(yīng)的23個Y-SNPs位點(diǎn)：P164、P203、P148、P145、M89、P151、M216、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M1ll、M9、P132、P200、P197、M119、P136和M134。其中，Ml1l是2 bp缺失，M134是l bp缺失突變，M199是1 bp插入，剩下20個位點(diǎn)均為堿基的轉(zhuǎn)換或顛換。

1.4.2 Y-SNPs位點(diǎn)PCR引物設(shè)計與驗(yàn)證 以NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫和Genbank中的Y染色體序列篩選的位點(diǎn)及其鄰近序列為模板，參照引物設(shè)計的一般原則，使用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計并使用Oligo 6.0軟件進(jìn)行分析優(yōu)化。引物合成后，采用基于局部比對搜索工具（BLAST）快速地對比分析它的高特異性。

1.4.3單個Y-SNPs位點(diǎn)PCR擴(kuò)增體系的建立 單位點(diǎn)PCR擴(kuò)增體系的建立。1個男性DNA樣本定量后，分別對23個Y-SNPs位點(diǎn)引物進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，建立每個SNP位點(diǎn)均適用的PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系為25μL，PCR反應(yīng)條件為：95℃11min，95℃30s、55℃30s、72℃30s，循環(huán)35次，最后延伸為72℃10min。

1.4.4 23個Y-SNPs位點(diǎn)復(fù)合PCR擴(kuò)增體系的建立 通過正交實(shí)驗(yàn)的方法，調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)、PCR反應(yīng)體系中各離子的濃度以及各引物對的濃度，建立23-plex Y-SNPs復(fù)合PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：0.4～1ng DNA模板、2.5 U AmpliTaqGold DNA聚合酶、1×PCR buffer、PCR引物濃度在0.006 8～0.0676μmol/L、每種dNTP各600μmol/L、8 mmol/L MgCl2。PCR反應(yīng)條件為：95℃11min，95℃30s、55℃40s、65℃45 s，循環(huán)35次，最后延伸為65℃10min[1]。

1.4.5 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測與純化 首先取15μL 10×上樣緩沖液與2μL PCR產(chǎn)物混勻后上樣至6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（C=6%，T=3.3%），450 V電泳2～3h，銀染顯色。然后，使用8μL或7μL酶純化體系進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.4.6單堿基延伸反應(yīng)體系的建立及其產(chǎn)物的純化 采用SNaPshot試劑盒（Applied Biosystem，美國）推薦的反應(yīng)體系：純化后的PCR產(chǎn)物、微測序引物混合物以及去離子水分別2μL，SNaPshot mix 4μL。循環(huán)參數(shù)為：96℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，循環(huán)25次。單堿基延伸反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)產(chǎn)物加入1μL SAP（1 U/μL），37℃孵育1h，80℃15 min進(jìn)行純化處理，并去除多余的引物和ddNTPs。

1.4.7熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳檢測 ①4種不同熒光物質(zhì)標(biāo)記ddNTPs，故ddNTP所發(fā)射的熒光量亦有差異，藍(lán)色（FAM）、綠色（HEX）、黃色（TAMRA）、紅色（ROX）熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光比約為4：2：1：1，判讀結(jié)果時必須對不同熒光標(biāo)記的RFU值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[2]；②采用3130-XL遺傳分析儀對純化后的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。取1μL純化產(chǎn)物加入10μL Hi-Di甲酰胺中，再加入0.3μL GeneScanTM Size Standards LIZ-120作為內(nèi)標(biāo)。進(jìn)樣時間10s，電壓15kV，POP-4凝膠，36cm毛細(xì)管，電泳30min。毛細(xì)管電泳結(jié)束后，使用Genemapper ID V3.2軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1檢測結(jié)果 23-plex Y-SNPs電泳檢測顯示：23個位點(diǎn)均為單倍型，各個位點(diǎn)PCR擴(kuò)增均衡，多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致。基因多樣性與單倍型多樣性的計算公式為：h=n（1-∑X2i）/（n-1）。經(jīng)法醫(yī)學(xué)參數(shù)計算，23個Y-SNPs位點(diǎn)均具有遺傳多態(tài)性，每個位點(diǎn)基因的多樣性范圍為0.0137～0.4912。檢測的290名男性個體中有11種單體群、143種單倍型，其單倍型多樣性為0.9907。

2.2法醫(yī)學(xué)應(yīng)用 ①靈敏度：倍比稀釋濃度為200ng/μL的參照DNA，分別進(jìn)行復(fù)合PCR反應(yīng)和復(fù)合單堿基延伸反應(yīng)，25μL復(fù)合體系中DNA含量為0.1～50ng時均可得到較好的分型結(jié)果；②種屬特異性：利用磁珠法提取雄性猴、狗、豬、雞、黃牛、山羊、家兔、大白鼠等動物的DNA.建立復(fù)合PCR擴(kuò)增體系，結(jié)果顯示動物標(biāo)本中均未檢測到任何Y-SNPs位點(diǎn)；③組織同一性：任何男性個體自身的骨骼、肋軟骨、肌肉組織、皮膚、肝臟、血痕、指甲等進(jìn)行23-plex Y-SNPs復(fù)合檢測，分型一致。

3 討論

本研究建立的23-plex Y-SNPs復(fù)合檢測體系具有良好的男性特異性和種屬特異性，檢測靈敏度高、重復(fù)性好。23-plex Y-SNPs復(fù)合檢測體系在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用是可行的，尤其是對父系家族的親權(quán)鑒定、無名男尸的個人識別、混合斑男性成分的檢驗(yàn)等具有積極意義[3～6]。常規(guī)DNA指紋、ABO血型、酶型、RFLP、STR等傳統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)物證檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中均存在一定的局限性。在刑事案件中，尤其是涉及追溯父子關(guān)系和性犯罪的案件，譬如：內(nèi)褲上精斑等犯罪案件的檢驗(yàn)樣本，采用直接檢測Y-SNPs的方法可有效避免傳統(tǒng)檢測的繁瑣步驟，從而快速獲得準(zhǔn)確的檢測效果。在23-plex Y-SNPs系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用STR系統(tǒng)和常染色體SNP檢測系統(tǒng)，其結(jié)果清晰、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧志輝，李茜，吳爽，等.17個Y-STR基因座在親子鑒定中的應(yīng)用研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008，16（3）：699-703.

[2]新堯，楊慶恩，劉超，等.法醫(yī)物證學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：68-76.

[3]張愛平，劉超，劉長暉.Y染色體SNPs及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].刑事技術(shù)，2009，5：32-34.

[4]鄧志輝，李茜，吳爽，等.17個Y-STR基因座在親子鑒定中的應(yīng)用研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008.16（3）：699-703.

[5]陳悅康，李茜，李大成，等.南方漢族無關(guān)男性群體17個Y-STR基因座單倍型遺傳多態(tài)性的研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，26（4）：351-354，386.

[6]黃代新，楊慶恩.武漢漢族群體23個Y染色體雙等位基因標(biāo)記遺傳多態(tài)性研究[J].遺傳，2006，28（7）：791-798.

編輯/成森