結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的臨床研究

摘要：結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)生的主要致病菌，傳染性強(qiáng)，具有較高的發(fā)病率和病死率。通常臨床診斷結(jié)核病時(shí)，對(duì)診斷方法要求高，需準(zhǔn)確、快速、特異性診斷，同時(shí)可以準(zhǔn)確判斷結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。目前結(jié)核分支桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法日益增多，而其檢測(cè)結(jié)果的敏感性和特異性并沒有顯著提高。本文就對(duì)結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行綜述研究，以此尋求簡單方便、準(zhǔn)確性高、應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法；結(jié)核病

結(jié)核病是目前世界嚴(yán)重性慢性傳染病，在早期WHO就以對(duì)結(jié)核病發(fā)出緊急預(yù)告。結(jié)核分枝桿菌也可稱為結(jié)核桿菌，在1882年Koch證明其是結(jié)核病病原體[1]。現(xiàn)今診斷技術(shù)、治療方法的改進(jìn)與發(fā)展，相應(yīng)降低了結(jié)核病的死亡率。但隨著而來的是結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)，使結(jié)核分枝桿菌耐藥率不斷上升，死亡率不減反增[2]。在治療和控制結(jié)核病時(shí)，主要是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法早期準(zhǔn)確對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷?，F(xiàn)綜述如下文。

1細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)

1.1直接厚涂片法 直接厚涂片法操作簡單、方便快速，成本低廉，是臨床診斷結(jié)核病細(xì)菌學(xué)常用方法。相關(guān)資料顯示采取直接厚涂片法，其檢出率與普通涂片法相比，其高出率高達(dá)19%[3]，是《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)范》中對(duì)結(jié)核病診斷的規(guī)定方法。

1.2集菌涂片法 集菌涂片法利用檢測(cè)標(biāo)本體積或離心、浮游等方法，使標(biāo)本中結(jié)核桿菌富集，操作復(fù)雜，應(yīng)用少。

涂片法的應(yīng)用，成本低廉，操作簡單，但敏感性約為37%，較低，特異性為94%[4]，無法有效準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。

1.3 BACTEC-TB-460快速檢測(cè)系統(tǒng) BACTEC-TB-460快速檢測(cè)系統(tǒng)可對(duì)結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行有效測(cè)定，于米氏7H12培養(yǎng)基中添加放射性14C量，陽性則為生長指數(shù)GI值超過19[5]。此種方法初代分離率較高，報(bào)告時(shí)間短，2d內(nèi)可檢出陽性標(biāo)本，而改良羅氏法最快需要約20d才可檢測(cè)出陽性結(jié)果，陰性檢測(cè)需2個(gè)月報(bào)告，而BACTEC-TB-460快速檢測(cè)系統(tǒng)只需1個(gè)月[6]。該法可分離分枝桿菌，在分枝桿菌藥敏試驗(yàn)和菌型鑒定中得到廣泛應(yīng)用。但該法污染率高，微量放射線，會(huì)污染環(huán)境，且操作技術(shù)水平要求高，價(jià)格高。

1.4變色液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法 結(jié)核分枝桿菌在實(shí)施培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，含有多種維生素、抗生素、谷氨酸鈉、變色劑、馬血清等營養(yǎng)豐富的選擇性培養(yǎng)基。其培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，其檢測(cè)率高。相關(guān)學(xué)者[7]報(bào)道，痰標(biāo)本陽性檢測(cè)時(shí)間約7d，發(fā)生率52%，污染率2.8%。在改良羅氏法檢測(cè)中檢出時(shí)間約20d，陽性率38%，污染率2.1%。

1.5 BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀 BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，通過在MGTI培養(yǎng)管中置入檢測(cè)標(biāo)本，管中營養(yǎng)成分和氧氣會(huì)被生長的分枝桿菌吸收，通過MGTI培養(yǎng)管中的氧氣濃度變化會(huì)相應(yīng)改變熒光顯示劑。當(dāng)氧氣消耗時(shí)會(huì)促使管內(nèi)熒光指示劑釋放熒光。培養(yǎng)儀報(bào)警，陽性指示器紅色，且液晶顯示屏?xí)@示檢測(cè)結(jié)果陽性位置，此種方法可有效判斷分枝桿菌，并進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)。

1.6噬菌體生物擴(kuò)增法 噬菌體生物擴(kuò)增法是在1997年所發(fā)現(xiàn)的快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的新型技術(shù)[8]。噬菌體生物擴(kuò)增法的應(yīng)用，在噬菌體能感染、裂解結(jié)核分枝桿菌等基礎(chǔ)上，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本中MTB利用特異性MTB噬菌體快速使其感染和裂解；未感染MTB的噬菌體經(jīng)殺病毒劑有效清除，繼續(xù)大量復(fù)制，以此裂解MTB，釋放子代噬菌體。子代噬菌體感染可生成敏感細(xì)胞，在瓊脂平板上肉眼可見敏感細(xì)胞菌苔的噬菌斑[9]。噬菌斑數(shù)量越多，結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量也越多。

2免疫學(xué)診斷技術(shù)

2.1結(jié)核抗體檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是至今診斷結(jié)核診斷常用方法，通過ELISA法可有效檢測(cè)患者血清中結(jié)核特異性抗體。斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)操作簡單、方便快速優(yōu)于ELISA，可單人份測(cè)定。免疫印跡試驗(yàn)特異性和敏感性較高，結(jié)合凝膠電泳與酶聯(lián)免疫技術(shù)[10]，可有效檢測(cè)血清結(jié)核抗體對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病，但操作較復(fù)雜，臨床應(yīng)用少。

2.2結(jié)核抗原檢測(cè) 結(jié)核抗原是機(jī)體感染結(jié)核桿菌后常見物質(zhì)，通過檢測(cè)結(jié)核抗原，可直接判斷結(jié)核桿菌的存在，降低患者因免疫應(yīng)答較低致假陰性的出現(xiàn)，該法通過對(duì)結(jié)核病患者血清結(jié)核抗原進(jìn)行檢測(cè)，以此判斷。在相關(guān)學(xué)者[11]報(bào)道中，采取結(jié)核抗原檢測(cè)方法檢測(cè)，其檢測(cè)敏感性高達(dá)84.17，特異性高達(dá)92.19%，可見，結(jié)核抗原檢測(cè)方法存在較高的敏感性及較強(qiáng)的特異性。

2.3細(xì)胞因子檢測(cè) 結(jié)核病患者在MT抗原激活下，血液或局部中T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞會(huì)釋放白細(xì)胞介素2受體、R干擾素、膜IL-2受體及A腫瘤壞死因子[12]，通過檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞因子，利用EILAS檢測(cè)方法，對(duì)患者血清、胸腔積液、腦脊液中細(xì)胞因子，可作為診斷結(jié)核病的輔助方法。

3分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.1定量PCT技術(shù) 此種方法在擴(kuò)增時(shí)添加特異性熒光探針及引物，在定量PCT技術(shù)中，相應(yīng)增加對(duì)引物及特異性熒光探針，通過根據(jù)熒光信號(hào)變化，以此對(duì)PCR整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板[13]，定量PCT技術(shù)較常規(guī)PCR相比，其具有更高的靈敏度，及更高的特異性，優(yōu)于常規(guī)PCR。且常規(guī)PCR會(huì)帶來一定污染，而采取定量PCT技術(shù)，避免常規(guī)PCR所帶來的污染性，具有較高的自動(dòng)化程度。

3.2分枝桿菌分子菌種鑒定 在鑒定分枝桿菌分子菌種時(shí)，其鑒定方法包括：PCR菌種鑒定、PCR直接測(cè)序鑒定、PCR限制性片段長度多肽性鑒定法、PCR-DNA探針鑒定法、PCR-基因芯片鑒定等方法[14]。PCR菌種鑒定、PCR直接測(cè)序鑒定、PCR限制性片段長度多肽性鑒定法、PCR-DNA探針鑒定法只能夠?qū)Σ糠志N進(jìn)行鑒定，PCR-基因芯片鑒定方法利用雜交測(cè)序?qū)Ψ种U菌菌種進(jìn)行鑒定[15]，操作簡單快速。

3.3分子藥敏試驗(yàn) 在對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過采取多種基因突變技術(shù)可有效檢測(cè)，一般分子機(jī)制可導(dǎo)致MT耐藥，通常在檢測(cè)時(shí)利用各種基因突變分析技術(shù)，可檢測(cè)出一定的耐藥性MT，但通常實(shí)際臨床檢測(cè)中依然存在耐藥分子機(jī)制。據(jù)相關(guān)資料顯示，多種基因突變技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變時(shí)，未有效檢測(cè)出高達(dá)40%耐藥分離株[16]，未能檢測(cè)出耐藥基因突變。

4總結(jié)

在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，常用方法涂片法、培養(yǎng)法、PCR法等，各種方法具有各自優(yōu)勢(shì)，其檢測(cè)的靈敏度、特異性也各不相同。應(yīng)掌握各種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，選擇準(zhǔn)確有效的診斷方法，明確結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn)，與其他病菌之間的關(guān)系，以此有效檢測(cè)、診斷和鑒別結(jié)核分枝桿菌，為臨床對(duì)結(jié)核病的早期治療和控制提供必要的參考依據(jù)。

通常結(jié)核分枝桿菌生長速度緩慢，一般在分裂時(shí)，其間隔時(shí)間是在18h，因此在培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，需耗費(fèi)較長的時(shí)間。為了提高臨床診斷確診率，需要有效統(tǒng)計(jì)分析我國體檢人員結(jié)核分枝桿菌的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，使相關(guān)人員能夠初步了解和基本掌握結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率及相關(guān)的藥敏耐藥率，同時(shí)檢測(cè)人員必須要認(rèn)識(shí)到結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)各項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)劣性，選擇最佳檢測(cè)技術(shù)，必要時(shí)可聯(lián)合各項(xiàng)技術(shù)，以此提高結(jié)核分枝桿菌檢出率，準(zhǔn)確判斷結(jié)核分枝桿菌，為臨床治療和診斷提供科學(xué)合理的參考依據(jù)。

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編輯/申磊