加味銀杏飲聯(lián)合骨髓干細胞移植對大鼠心肌損傷的影響

摘要：目的 制作大鼠心肌損傷模型，采用加味銀杏飲聯(lián)合骨髓間干細胞（BoneMesenchymalstemcells，BMSCs）移植干預，觀察心肌細胞凋亡、心功能，從而探討加味銀杏飲的作用機制。方法 采用松開左冠狀動脈前降支結扎的方法建立大鼠心肌損傷的模型，將大鼠分為移植組、加味銀杏飲聯(lián)合移植組等兩組，觀察心肌毛細血管密度（MCD）、心肌纖維化。結果 聯(lián)合移植組與單純移植組大鼠心功能均有所改善，而加味銀杏飲聯(lián)合移植組改善更明顯。其AI較單純移植組明顯減少，而缺血區(qū)MVD 明顯增加。結論 在心肌損傷大鼠模型中，加味銀杏飲聯(lián)合細胞移植可以減少梗死區(qū)面積，增加梗死區(qū)心室厚度，促進梗死區(qū)血管再生，改善心功能；同時，加味銀杏飲干預能促進大鼠心肌細胞增殖，比單純細胞移植效果明顯；加味銀杏飲聯(lián)合細胞移植能增加移植BMSCs的存活率，在改善大鼠心功能，促進血管再生，促進心肌細胞增殖方面優(yōu)于細胞移植組和中藥組。

關鍵詞：骨髓干細胞；心肌損傷；加味銀杏飲；移植好

心肌損傷是心肌的壞死，病情兇險。目前治療手段主要以藥物和冠狀動脈介入手術為主，這些手段在一定程度上可以緩解患者的癥狀，但均難從根本上解決問題，本實驗采用加味銀杏飲聯(lián)合骨髓干細胞移植治療實驗性大鼠心肌損傷，以觀察其療效并探討其可能的作用機制。具體實驗方法和結果報道如下。

1 資料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物2 月齡SD大 鼠 3 只（制備MSCs用），雄性，體質(zhì)量 （100±20）g；健康成年SD大 鼠16只，雄性，體質(zhì)量 （250±20）g，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學動物中心提供。

1.1.2藥物銀杏飲組（銀杏30g、檀香5g、砂仁5g）和加味銀杏飲組（銀杏20g，檀香6g，砂仁5g，赤芍10g，川芎6g，當歸6g，紅花6g，生地12g，黃芪20g），由湖南株洲中醫(yī)院藥劑科提供 。

1.1.3 主要儀器與試劑 小動物呼吸機、二氧化碳孵箱（HERA cel 1），激光共聚焦顯微鏡，percol1 分離液（pharmacia 公司），F(xiàn)12～DMEM 培養(yǎng)基、進口胎 牛血清 （JIBCO 公司），BrdU （pharmacia 公司），小 鼠抗 BrdU單克隆抗體，小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠二抗，HP5500 超聲診斷儀，TUNNEL 試劑盒 （武漢博士德生物技術公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1分組 成年SD大鼠20只分為加味銀杏飲聯(lián)合移植組 與單 純移植組，造模前分別灌服等體積加味銀杏飲浸膏干粉溶劑以及生理鹽水進行灌服14d。

1.2.2干細胞的分離、培養(yǎng)以及純化 研究中將3只幼齡大鼠殺死，將其浸泡在75%的乙醇中，浸泡時間控制在5min，然后采用PBS對大鼠體進行有效的沖洗，然后去下大鼠的股骨、脛骨等組織并將其放在平皿中，更換相關器械，將大鼠周圍肌肉組織除去，并采用PBS沖洗。將大鼠骨干的兩個關節(jié)面去除，使得骨髓腔充分暴露，并采用7號針頭將兩骨端進行穿刺，利用5 mL10%FBS的 F12～DbIEM 沖出骨髓入離心管，1500 r/min 離心10 min。棄上清，用 F12～DMEM重懸細胞，輕輕疊加到新鮮配制的密度為1.073的percol 1分離液上，然后進行30min離心，離心速度控制在2500 r/min，取上層渾濁液，并采用PBS進行2次洗滌，最后使用F12～DMEM 培養(yǎng)液 （培養(yǎng)液中主要有10%胎牛血清、100U/mE青霉素等）重懸細胞，按1×10 /mE密度進行接種，37 ℃、5%飽和濕度的c0。孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后更換培養(yǎng)液，并將未貼的細胞壁去除。接近融合的MSCs用含 0.1 mmo l/LEDTA 的 0.25%胰酶室溫消化，按 1：3 比例傳代，傳至第3代。MSCs回植前48h ，換用含 5 ～unol/L 5～BrdU的F12～DbIEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) 。臨用前加入 0.25%胰蛋 白酶消化 ，然后進行離心，并搜集目標細胞，并根據(jù)情況調(diào)整細胞密度。

1.2.3造模 在15d左右采用O1ivette方法對兩組法術進行分析，并建立冠狀動脈建立急性心肌損傷模型。建模過程中采用50mg/kg 戊巴比妥對大鼠進行腹腔麻醉，并建立靜脈通道，讓大鼠心臟完全暴露，采用以4～0 無損傷線進行灌裝動脈前支結扎。兩組大鼠進行1h后結扎，并且在直視下采用微量注射器在大鼠心肌梗死周圍進行標記，并植入標記 5～BrdU 的 MSCs（5 ×10個細胞/100 pL），每點 25，關胸。

1.2.4 缺血區(qū)微血管密度檢測 冰凍切片 PBS 沖洗兩遍，加入1：50 抗 CD31 小鼠單抗，放在溫度為4℃下過夜，PBS 洗滌后加 1 ：50 FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育 50 m in，洗 片后用伊文氏蘭復染，50%緩沖甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察 CD31 陽性細胞，CO31 陽性細胞胞漿呈綠色，采用高倍鏡視野對大鼠毛細血管進行觀察，并采用CD31 陽性數(shù)表示，每張取5個視野。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 搜集的數(shù)據(jù)采用SPSS16軟件分析，計數(shù)資料行卡房檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t檢驗，采用（均數(shù)±方差）表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1骨髓間充質(zhì)干細胞變化 接種后的細胞24h可見較多圓形細胞懸浮在培養(yǎng)液中，48 h可見貼壁細胞，較懸浮細胞體積大，大小較均一，核大多為圓形，位于細胞中央。8～9d 后，部分細胞成梭形，個別成三角形。換液后 5～7d 基本融合鋪滿，至第 3 代，細胞呈長梭形集落樣分布，形態(tài)較均一。

2.2組大鼠移植后4w心肌缺血區(qū)微血管密度檢測 400 倍視野下，聯(lián)合移植組微血管密度即CD31 陽性細胞（243±20.3）。較單純移植組 （197±12.6） 明顯增加（P<0.05）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過冠脈或心肌局部注射將 MSCs 導入心肌缺血的微環(huán)境中?？梢苑只癁檠軆?nèi)皮細胞 （Ec）。促進局部血管新 生。達到 改善 心肌 缺血 目的，從而成 為心血 管領域 的研究熱點。新生血管的形成可降低梗死灶周邊肥大心肌細胞的凋 亡，挽救有活力的心 肌細胞，減少膠 原沉著 ，改善心功 能 。但由于 MSCs 在體內(nèi)缺血微環(huán)境中的分化效率有限，因此，是否存在一種方法可以提高 MSC s 的分化效率，增加血管新生，提高療效呢？ 本實驗旨在觀察和探討應用加味銀杏飲聯(lián)合 MSCs 移植可否促進 MSC s 向血管內(nèi)皮細胞分化，從而提高局部 MvD，改善心功能，降低心肌細胞凋亡。研究結果發(fā)現(xiàn)：加味銀杏飲聯(lián)合移植組心功能改善更為明顯，且聯(lián)合移植組心肌細胞凋亡指數(shù)較單純移植組明顯降低，MvD 明顯增加。表明加味銀杏飲具有協(xié)助 MSCs 移植 治療心肌 損傷 、提高局部微血管密度、改善心功能、減少心肌細胞凋亡的作用，可望為臨床協(xié)助 MSCs 移植增加療效提供一種安全、有效的治療手段 。

參考文獻：

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編輯/馮焱