亞硝基谷胱甘肽對(duì)雞球蟲(chóng)脫囊的影響

摘要：為了解膽酸鹽濃度、作用時(shí)間兩種因素對(duì)亞硝基谷胱甘肽——GSNO處理雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）孢子化卵囊脫囊的影響，試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)方法，通過(guò)鏡檢子孢子脫囊率來(lái)確定雞球蟲(chóng)卵囊經(jīng)GSNO處理后體外脫囊的最佳條件。結(jié)果表明，在膽酸鹽濃度為0.75%，作用時(shí)間為2 h時(shí)，GSNO處理孢子化卵囊的脫囊率最高。

關(guān)鍵詞：亞硝基谷胱甘肽；柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；脫囊

中圖分類號(hào)：S831；S852.72+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2173-03

雞球蟲(chóng)病是現(xiàn)代規(guī)模養(yǎng)禽業(yè)中最常見(jiàn)、最難凈化且危害嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病之一，由于球蟲(chóng)病在雞各個(gè)生長(zhǎng)階段的發(fā)病率和致死率都比較高，因而給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了很大的沖擊，全球每年因球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)10億美元[1]，同時(shí)，抗球蟲(chóng)藥的廣泛使用所引起的藥物殘留已成為影響人類健康的巨大隱患，因此能否有效控制雞球蟲(chóng)病顯得意義重大。

Allen于1998年首次發(fā)現(xiàn)感染E.tenella的雛雞體內(nèi)NO水平明顯高于未感染的對(duì)照組[2]，傅小平等[3]研究也得出相同結(jié)論，這提示NO可能參與了球蟲(chóng)感染的過(guò)程，并在抗球蟲(chóng)感染中發(fā)揮著重要作用。由于NO的理化性質(zhì)極不穩(wěn)定，很難直接利用NO或NO的溶液對(duì)其特性進(jìn)行研究，而利用NO供體來(lái)模擬NO活性是研究NO的一種重要手段[4]。有研究表明[5]，S-亞硝基硫醇類NO供體（GSNO）可以不可逆地抑制柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高達(dá)100%。動(dòng)物試驗(yàn)也表明，GSNO處理可以明顯降低孢子化E.tenella卵囊對(duì)雛雞的致病力[6]。本研究采用體外脫囊正交試驗(yàn)方法，通過(guò)鏡檢子孢子脫囊率來(lái)評(píng)價(jià)GSNO處理孢子化卵囊體外脫囊的最佳條件，從而進(jìn)一步探討GSNO對(duì)雞球蟲(chóng)卵囊的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊，揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存株，經(jīng)雛雞傳代獲取新鮮的未孢子化卵囊，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹8]。

1.2 主要試劑

還原型谷胱甘肽、胰酶（上海金穗生物科技有限公司），亞硝酸鈉（無(wú)錫市晶科化工有限公司），牛膽酸鹽（Ward blenkinsop Co LTD）。

GSNO：亞硝基硫醇類（RSNO）NO供體，依照Stefan F[7]介紹的方法制備。

1.3 方法

1.3.1 孢子化卵囊的準(zhǔn)備 將分離的未孢子化卵囊加入2.5%重鉻酸鉀溶液于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行孢子生殖，待95%左右的卵囊出現(xiàn)斯氏體[9]后，收集孢子化卵囊，用滅菌水洗滌并離心[10]，重復(fù)3次以除去重鉻酸鉀溶液。

1.3.2 卵囊的前處理 取新鮮的孢子化卵囊，將其分成3組，用0、8、16 mmol/L的GSNO在4 ℃冰箱處理8 h，離心3次棄去GSNO，不同GSNO處理再分成3組，用研磨器研磨上述9組不同處理的卵囊，直至90%左右的孢子囊從卵囊壁游離出來(lái)，離心3次調(diào)整各組孢子囊濃度為60×105個(gè)/mL。

1.3.3 體外脫囊試驗(yàn) 為確定膽酸鹽濃度和消化液作用時(shí)間對(duì)GSNO處理孢子化卵囊脫囊試驗(yàn)的影響，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，各因素每個(gè)水平設(shè)置6個(gè)重復(fù)，以計(jì)算的子孢子脫囊率為指標(biāo)來(lái)考察子孢子脫囊的最佳條件，因素與水平見(jiàn)表1。在上述9組孢子囊中分別加入不同處理的消化液，按下表內(nèi)容進(jìn)行操作，40 ℃消化不同時(shí)間后在顯微鏡下記錄子孢子數(shù)，計(jì)算子孢子脫囊率。子孢子脫囊率的公式為：子孢子脫囊率=子孢子數(shù)/（子孢子數(shù)+孢子囊數(shù)×2）×100%[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

從表2可知，各因素水平的優(yōu)劣順序是：B1>B3>B2，C3>C2>C1。0.75%的膽酸鹽濃度使球蟲(chóng)子孢子更易從孢子囊中脫出，消化液與孢子化卵囊作用時(shí)間越長(zhǎng)，子孢子脫囊越完全。

由表3結(jié)合F值表可知，F(xiàn)0.05（2，42）=3.22，F(xiàn)0.01（2，42）=5.15。FB（3.431）>F0.05，表明B因素的各水平差異顯著（P<0.05）；FC（5.063）>F0.05，表明C因素的各水平差異顯著（P<0.05），這說(shuō)明膽酸鹽濃度和消化液處理卵囊時(shí)間對(duì)GSNO處理孢子化卵囊的脫囊有顯著影響。

方差分析表明，膽酸鹽濃度（B）、作用時(shí)間（C）對(duì)GSNO處理孢子化卵囊的主次順序?yàn)椋篊>B，即：消化液處理卵囊時(shí)間越長(zhǎng)，子孢子脫囊率越高。由于各因素間沒(méi)有交互作用，各因素效應(yīng)可相加，故B與C最佳水平的組合也是最佳的，對(duì)于GSNO處理孢子化卵囊的脫囊率最高的組合為B1C3，即膽酸鹽濃度0.75%，消化液作用時(shí)間為2 h時(shí)，子孢子脫囊最徹底。

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的卵囊壁是一個(gè)堅(jiān)固的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且能夠耐受機(jī)械性損傷，卵囊對(duì)于化學(xué)制品、消化酶、洗滌液以及低滲溶液的破壞具有相當(dāng)?shù)牡挚沽?，常?guī)的消毒劑很難破壞球蟲(chóng)的卵囊壁結(jié)構(gòu)。對(duì)于成熟的孢子化的卵囊，必須采用特殊的機(jī)械方法才能在某種程度上破壞卵囊壁，本試驗(yàn)研究表明，采用研磨器機(jī)械破碎的方法對(duì)于卵囊壁的破裂能夠取得較好的效果。

體外脫囊試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了GSNO對(duì)于孢子化卵囊的體外消毒效果，邢濤等[12]研究表明經(jīng)GSNO處理的孢子化卵囊的脫囊減少率均值為20.8%；李金貴等[6]報(bào)道GSNO可以不可逆地抑制未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高達(dá)100%，這提示球蟲(chóng)的卵囊壁在卵囊成熟前后可能發(fā)生了形態(tài)或生理上的變化，可能對(duì)GSNO處理具有一定的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，膽酸鹽濃度為0.75%，作用時(shí)間為2 h時(shí)，GSNO處理孢子化卵囊的子孢子脫囊率最高。膽酸鹽濃度與其他文獻(xiàn)的報(bào)道相一致，而脫囊液作用時(shí)間則比其他文獻(xiàn)報(bào)道的時(shí)間長(zhǎng)[13]，這表明消化液處理時(shí)間越長(zhǎng)子孢子脫囊越完全。

在本試驗(yàn)中，對(duì)于16 mmol/L GSNO處理的成熟孢子化卵囊，其子孢子脫囊率的均值為43.72%，而未經(jīng)任何處理的卵囊其脫囊率高達(dá)96.69%[11]，該結(jié)果表明GSNO能在一定程度上抑制雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊的脫囊，這提示GSNO在預(yù)防和控制雞球蟲(chóng)病方面有廣闊的應(yīng)用前景。

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