依山紅顆粒劑質(zhì)量控制研究

摘要：為了建立壯藥依山紅顆粒劑的質(zhì)量控制方法，采用薄層色譜法對壯藥依山紅顆粒劑進(jìn)行鑒別；采用HPLC法測定顆粒劑中槲皮素的含量，色譜條件：色譜柱為Gemini-NX 5 μm C18 110A柱；流動相為甲醇-0.1%磷酸（40∶60，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為365 nm。槲皮素進(jìn)樣量在0.02～0.32 μg內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 5），平均回收率為101.81%，RSD為4.27%（n=6）。所建立的測定方法靈敏度高、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于壯藥依山紅顆粒劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：依山紅顆粒劑；槲皮素；質(zhì)量控制

中圖分類號：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2232-02

壯藥依山紅是從壯族民間挖掘出來的治療乙型肝炎經(jīng)驗(yàn)方，該方由壯藥滿山紅、毛雞骨草、牛大力、田基黃和黃根等藥材組成，對慢性乙型肝炎具有較好的治療效果?，F(xiàn)代研究證明，方中君藥滿山紅主要有效成分為楊梅素、槲皮素、金絲桃苷、異金絲桃苷等黃酮類成分[1]。黃酮類成分槲皮素具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗菌[4，5]、保護(hù)心血管等作用[6，7]，槲皮素及其衍生物可對肝癌細(xì)胞顯出比較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，能有效抑制肝癌細(xì)胞的生長，對肝損傷具有良好的保護(hù)作用及一定的抗肝纖維化的作用，在治療肝臟疾病中有著廣闊的應(yīng)用前景[8]。測定藥材中槲皮素含量多用高效液相色譜法[9，10]。本研究對前期制備的壯藥依山紅顆劑粒進(jìn)行質(zhì)量控制，建立以槲皮素為標(biāo)識物的TLC鑒別和HPLC含量測定方法，為壯藥依山紅顆粒劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

日本島津LC-20A高效液相色譜儀；Gemini-NX 5 μm C18 110A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；槲皮素對照品（批號：10081-9905），購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈（西隴化工股份有限公司，色譜純），其他試劑均為分析純。壯藥依山紅顆粒劑為自制，批號分別為20130802、20130810、20130816。

1.2 壯藥依山紅顆粒劑薄層色譜鑒定方法

1.2.1 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取依山紅顆粒劑2 g，置錐形瓶中加甲醇40 mL，密塞，超聲提取30 min，過濾，取濾液作為供試品溶液。

1.3 壯藥依山紅顆粒劑含量測定分析方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Gemini-NX 5 μm C18 110A（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸（40∶60，V/V）；檢測波長為365 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)算應(yīng)不少于5 000。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品1.0 mg，加甲醇使溶解并稀釋至25 mL，搖勻，即得每1 mL含40 μg的對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取壯藥依山紅顆粒劑粉末2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 壯藥依山紅顆粒劑薄層鑒定

按“1.2.2”項(xiàng)下制備3個批號的供試品溶液，在高效薄層硅膠G板點(diǎn)樣，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（4∶4∶1，V/V/V）為展開劑，噴三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 mm）下觀察。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，重現(xiàn)性較好（圖1）。

2.2 壯藥依山紅顆粒劑含量測定方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=5×10-6x+7×10-2（R2=0.999 5），結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在0.02～0.32 μg內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品試液6 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.3.1”項(xiàng)色譜條件分別測其峰面積值，計(jì)算RSD值為0.23%，表明所用儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批（20130802）壯藥依山紅顆粒劑，按“1.3.3”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算得出槲皮素的平均含量為0.099 mg/g，結(jié)果RSD值為2.12%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取同一批（20130802）壯藥依山紅顆粒劑，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，常溫保存，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣測定。結(jié)果含量RSD值為0.76%（n=6）。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批號（20130802）樣品1 g，精密稱定，再分別精密加入濃度為0.05 mg/mL的槲皮素對照品溶液1 mL，按“1.3.3”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測定其含量，計(jì)算回收率。平均加樣回收率為101.81%，RSD值為4.27%（n=6）。

2.2.6 樣品含量測定 稱取各批號壯藥依山紅顆粒劑粉末2 g，精密稱定，按“1.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣6 μL進(jìn)行測定，以峰面積計(jì)算槲皮素的含量。同一批次顆粒平行測定3份，取平均值。對照品色譜圖及樣品色譜圖分別見圖2、3，3批壯藥依山紅顆粒中槲皮素的測定結(jié)果見表1。

3 小結(jié)與討論

3.1 樣品處理方法的考察

在制備供試品溶液時，考察了甲醇、乙醇等提取溶劑對槲皮素含量的影響，同時也考察了提取方法，如超聲提取、回流提取、冷浸提取，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑，采取超聲提取法，顆粒劑中槲皮素的含量與回流提取相當(dāng)，超聲提取操作簡便，故選用超聲提取的方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在色譜條件考察中，因?yàn)橹笜?biāo)性成分槲皮素為黃酮類成分，偏酸性，故在試驗(yàn)同時考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸等流動相對分離度的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V）為流動相時，保留時間適中，分離度大于1.5，故采用此溶液作為流動相。本研究所建測定方法靈敏、重現(xiàn)性好、簡單快速，可用于壯藥依山紅顆粒制劑的質(zhì)量控制。

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