九種植物提取物對小麥白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

摘要：以水和50%乙醇做為溶劑，提取9種植物的活性物質(zhì)，通過小麥白粉病菌孢子萌發(fā)試驗進行抑菌活性測定。結(jié)果表明，9種植物50%乙醇提取液都能抑制小麥白粉病菌孢子萌發(fā)，僅有山蒼子和辣椒的水提取液對小麥白粉病菌孢子萌發(fā)有抑制作用。因此，可嘗試以上述植物為原料研制植物源農(nóng)藥來防治小麥白粉病。9種植物提取物對白粉病菌孢子萌發(fā)的影響與提取物成分、濃度相關(guān)，將大蒜、女貞子（烘干）、辣椒和煙皮的乙醇提取液稀釋11.00倍，辣椒水提液稀釋2.25倍仍然表現(xiàn)出較強的抑菌活性。不同提取液中抑制小麥白粉病菌孢子萌發(fā)的活性物質(zhì)的種類還需進一步研究。

關(guān)鍵詞：植物提取物；抑菌活性；小麥白粉病菌；孢子萌發(fā)

中圖分類號：S435 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2127-05

小麥白粉病是在全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生、危害程度嚴重的三大病害之一，近年來在中國近半數(shù)的麥田中發(fā)生與流行，尤其是在黃淮平原，頻繁多發(fā)[1，2]。小麥葉片受侵染后，呼吸強度增加，光合效率降低[3]，導(dǎo)致干物質(zhì)積累減少，輕病田減產(chǎn)5%～10%，重病田減產(chǎn)20%以上[4，5]。生產(chǎn)上選用抗病品種和使用殺菌劑是防治白粉病的兩個主要措施[6]。但中國小麥品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，抗病品種育種進程緩慢；已有抗性品種由于長期使用導(dǎo)致其抗病性逐漸喪失，以至于近年來白粉病的危害日益嚴重[7，8]。三唑類藥劑是防治小麥白粉病的重要藥劑，但由于長期使用，一方面導(dǎo)致病原菌的抗藥性逐年增強[6]；另一方面，隨著農(nóng)藥殘留、食品安全與環(huán)境生態(tài)安全等問題越來越受到重視，三唑類藥劑防治存在弊端日益突出，因此在生產(chǎn)實踐中急需安全有效的白粉病防控技術(shù)。

植物是生物活性化合物的天然寶庫，其中的大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)，如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾體、酚類、獨特的氨基酸和多糖等均具有殺蟲或抗菌活性。近年來對植物提取物的抑菌、殺菌活性進行了廣泛而深入的研究。張應(yīng)烙等[9]對井岡山47種植物提取物的研究發(fā)現(xiàn)，山雞椒、凹葉厚樸和深山含笑提取物中含有抗菌成分，且抑菌譜較廣，值得進一步研究。喻大昭等[10]以黃瓜灰霉病菌為供試菌，對49種植物粗提物進行了生物活性篩選，結(jié)果表明，油茶和辣蓼粗提物的抑菌活性較高。陳嬌等[11]通過58種植物提取液對葡萄霜霉病菌的游動孢子囊萌發(fā)抑制率和接種葉圓盤的發(fā)病控制進行研究，篩選出虎耳草、黃檀、馬尾松、牡丹、刺槐5種具有抑菌作用的植物提取液。孫海峰等[12]以龍膽斑枯病菌為供試菌，對9種中藥乙醇提取物進行抗菌活性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種中藥乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子、知母具有較強的抗龍膽斑枯病菌作用。目前報道有1 389種植物有可能作為殺菌劑，植物中的抗毒素、類黃酮、罹病相關(guān)蛋白質(zhì)、有機酸和酚類化合物等均具有殺菌或抗菌活性[13]。上述研究結(jié)果為今后從事植物源殺菌劑的進一步研究提供了很好的支持。本研究以小麥白粉病菌為供試菌，研究9種植物提取物對該菌孢子萌發(fā)的抑制作用。一方面，比較不同植物提取物抑菌效果差異，為進一步深入研究其抗菌成分奠定基礎(chǔ)；另一方面，為研制抗小麥白粉病的新型植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：山蒼子購自安徽亳州中藥材批發(fā)市場；辣椒、大蒜購自西昌市農(nóng)貿(mào)市場；女貞子、小葉女貞子、小葉黃楊果實采自西昌學(xué)院校園；烤煙葉片和莖稈表皮采自西昌學(xué)院教學(xué)實習(xí)農(nóng)場。白粉病菌孢子采自西昌學(xué)院教學(xué)實習(xí)農(nóng)場溫室。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物樣品提取 供試植物材料在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中高溫（55 ℃）烘干至恒重，用煙葉專用粉碎機粉碎，山蒼子過孔徑為1 mm的鋼篩，其余材料過50目鋼篩，粉碎物料裝入棕色廣口瓶中避光、干燥保存?zhèn)溆?。分別采用去離子水和50%乙醇兩種溶劑提取植物樣品成分。準(zhǔn)確稱取1.50 g試樣于三角燒瓶中，加入50 mL溶劑混勻。以去離子水做提取溶劑的處理：將其置100 ℃水浴鍋中，浸提3 h，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，用去離子水定容至50 mL。50%乙醇做提取溶劑的處理：將其置30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，浸提15 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，用50%乙醇定容至50 mL。

1.2.2 提取液多糖含量測定 ①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.20 g，置100 mL容量瓶中，加去離子水溶解定容，制成2.000 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 、0.9、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，去離子水定容至刻度，配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。②蒽酮-硫酸試液的配制：稱取0.200 g蒽酮和1.000 g硫脲，加入100 mL濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻置暗處備用。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別準(zhǔn)確移取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于具塞試管中（各平行3份），以1 mL去離子水作為空白，各加入5 mL蒽酮試劑（立刻搖勻，置冰水浴中），置于沸水浴10 min， 迅速置冰水浴冷卻10 min后，在波長為626 nm處測定吸光度4次。計算線性回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。④樣品溶液的測定：分別準(zhǔn)確移取待測樣品溶液1 mL于具塞試管中（各設(shè)平行3份），以1 mL去離子水作為空白，各加入5 mL蒽酮試劑（立刻搖勻，置冰水浴中）， 置于沸水浴10 min，迅速置冰水浴冷卻10 min，以首管作為空白，在波長為626 nm處測定吸光度4次。

1.2.3 白粉病孢子萌發(fā)試驗 ①水-瓊脂培養(yǎng)基制備：稱取4.00 g瓊脂粉，加100 mL去離子水混勻，在高壓滅菌鍋中滅菌15 min，取出后倒在玻璃板上，鋪成厚度約為1.0 mm的培養(yǎng)基。用無菌打孔器在培養(yǎng)基上打孔，取出瓊脂片，在植物提取液中浸泡48 h備用，以提取溶劑作為空白對照。②孢子萌發(fā)：從小麥葉片上剪下梭形白粉病孢子堆，將孢子印在浸泡48 h的瓊脂片上，然后放在載玻片上，放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察孢子萌發(fā)狀態(tài)。依據(jù)萌發(fā)孢子的數(shù)量和芽管長度，將孢子萌發(fā)狀態(tài)分為5級（表1，圖1）。③最小抑菌濃度測定：分別將300、600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 μL提取液原液加入到3 000 μL提取溶劑中，使提取液濃度分別稀釋為原液濃度的11.00、6.00、4.33、3.50、3.00、2.67、2.43、2.25倍。用稀釋后的提取液浸泡瓊脂片48 h做為孢子萌發(fā)載體，觀察孢子萌發(fā)狀態(tài)。以孢子不萌發(fā)時的稀釋濃度為最小抑菌濃度，分別以相應(yīng)提取溶劑作空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2003和SPSS 17.0進行回歸分析、方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物多糖含量測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），葡萄糖含量在波長626 nm處與吸光度呈良好的線性關(guān)系，y=4.874 5x-0.056 5（R2=0.97）。9種植物提取物多糖含量測定結(jié)果見表2。測定結(jié)果表明，以去離子水做為提取溶劑，在100 ℃水浴中浸提3 h，不同植物材料提取液的多糖含量差異極顯著（F=2 391.862，P=0.000）；其中大蒜提取液中多糖含量最高，達到15.56 mg/mL，其次為小葉女貞子和煙葉，山蒼子提取液含量最低，僅0.64 mg/mL。以50%乙醇為提取溶劑，在30 ℃振蕩提取15 h，不同植物材料提取液的多糖含量差異也達到極顯著水平（F=336.602，P=0.000）；其中仍然是大蒜提取液中多糖含量最高，達到14.73 mg/mL，其次為小葉女貞子、小葉黃楊和煙葉，山蒼子提取液含量最低，僅0.61 mg/mL。

同一種植物材料用不同溶劑處理，其多糖含量也有極顯著或顯著差異。其中煙皮水提取液的多糖含量極顯著高于50%乙醇提取液，相差達4.96 mg/mL（t=68.619，P=0.00）；女貞子（曬干）、辣椒、大蒜水提取液的多糖含量也極顯著高于50%乙醇提取液（t值分別為4.457、14.254和3.001）；小葉黃楊、煙葉和小葉女貞子水提取液的多糖含量極顯著低于50%乙醇提取液（t值依次為15.922、1.217和3.681）；女貞子（烘干）、山蒼子和煙葉的水提取液的多糖含量與50%乙醇提取液的含量差異不顯著。

2.2 不同提取液對小麥白粉病孢子萌發(fā)的影響

分別用在水提取液和50%乙醇提取液中浸泡48 h的瓊脂片做為孢子萌發(fā)載體，在15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h后鏡檢，以5級分類法評價孢子萌發(fā)狀態(tài)（表3）。結(jié)果表明，不同提取液對小麥白粉病孢子萌發(fā)程度有不同的影響。在辣椒和山蒼子的水提取液浸泡的瓊脂片上，48 h仍然未觀察到開始萌發(fā)的孢子，表明兩種提取液能抑制白粉病孢子萌發(fā)；其余幾種提取物在24 h內(nèi)延遲孢子萌發(fā)，48 h時孢子萌發(fā)程度與空白對照接近。9種植物的50%乙醇提取液，均能有效抑制白粉病孢子萌發(fā)，除煙葉提取液中有少數(shù)孢子開始萌發(fā)外，其余幾種提取液在48 h仍然未發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的孢子。表明不同溶劑對提取液的成分有重要影響，9種植物的提取液中50%乙醇具有抑菌活性的成分比水提取液要多。

2.3 提取液的最低抑菌濃度

不同的植物的水提取液對小麥白粉病孢子萌發(fā)的抑制活性不同，從提取液的最低抑菌濃度來看，辣椒水提液抑菌活性最強，最低抑菌濃度為稀釋2.25倍；然后是山蒼子水提液，其最低抑菌濃也為稀釋2.25倍，但其稀釋6.00倍時孢子萌發(fā)程度即與對照相同，且高于辣椒水提液（表4）。其余幾種植物水提液在稀釋后，孢子萌發(fā)程度基本與對照無明顯差異。

50%乙醇提取液在梯度稀釋后，抑菌活性也有較明顯變化。大蒜、女貞子（烘干）、辣椒和煙皮的最低抑菌濃度都是稀釋11.00倍，表現(xiàn)出較強的抑菌活性；其次是小葉黃楊和女貞子（曬干），最低抑菌濃度是稀釋3.00倍；然后是小葉女貞子，其最低抑菌濃度是稀釋2.67倍；煙葉在稀釋2.25倍時有少數(shù)孢子萌發(fā)，但孢子萌發(fā)程度與對照差異較大，絕大多數(shù)孢子都未萌發(fā)（表4）。

3 小結(jié)與討論

一方面，植物的抑菌活性物質(zhì)成分復(fù)雜、多樣，不同植物中所含的主要抑菌活性物質(zhì)也有所不同，如苦參中含有苦參堿[13，14]，蛇床子中含有蛇床子素、香豆素[15]，黃柏中含有小檗堿[16]，木姜子揮發(fā)性油中含的萜類物質(zhì)等[17]。另一方面，具有抑菌活性的植物提取物中，既有主要成分，也有輔助成分，如多糖等。多糖是植物中普遍存在的一類物質(zhì)，也是植物抑菌活性物質(zhì)之一。研究表明，不同濃度的大葉木姜子葉多糖水溶液對金黃色葡萄球菌、酵母菌、灰綠曲霉和黑曲霉均有一定的抑制作用，并且都有隨著濃度的增加，抑菌效果增強的趨勢[18]。海帶多糖對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌均有一定的抑制作用[19]；魚腥草多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用[20]。本研究表明，中山蒼子和辣椒的水提取液和50%乙醇提取液都能抑制小麥白粉病孢子萌發(fā)，但其抑菌活性明顯與多糖含量高低無關(guān)，其提取物中的其他物質(zhì)是其主要的抑菌活性成分。而小葉黃楊、煙葉和小葉女貞子僅50%乙醇提取液能抑制小麥白粉病孢子萌發(fā)，且這3種植物的醇提取液的多糖含量均極顯著高于水提取液，說明其多糖可能是主要的抑菌活性物質(zhì)之一。

分生孢子的萌發(fā)是白粉病田間流行和再侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，抑制分生孢子萌發(fā)就可以有效控制病害流行，減輕其危害程度。劉彩云等[21]研究表明，不同形態(tài)硅源制劑對白粉菌孢子萌發(fā)有較大影響，進而對白粉病產(chǎn)生一定的防治效果。本研究中3種水提取液和9種50%乙醇提取液均對小麥白粉病孢子萌發(fā)有不同程度的抑制作用，有關(guān)這些植物提取物對小麥白粉病的抑制效果或防治效果尚有待于進一步的田間試驗研究。

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