虎杖PcPKS1基因RNAi載體的構(gòu)建

摘要：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）是富含芳香族聚酮化合物的藥用植物，Ⅲ型聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）對(duì)芳香族聚酮化合物的合成起重要作用。為了研究虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因PcPKS1的功能，分別選取PcPKS1基因的編碼區(qū)保守序列（574 bp）和3′端非編碼區(qū)特異序列（209 bp）作為干擾片段。將選定的干擾片段，分別以正向和反向插入到pYLRNAi 載體中GUS基因內(nèi)含子的兩側(cè)，以形成hpRNA表達(dá)盒，成功構(gòu)建了以組成型CaMV35S為啟動(dòng)子，以潮霉素抗性為篩選標(biāo)記的RNA干擾表達(dá)載體pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR，并將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。

關(guān)鍵詞：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）；III型聚酮合酶；查爾酮合酶；RNA干擾；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2255-05

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）為蓼科蓼屬多年生草本植物，也是富含芳香族聚酮化合物的藥用植物[1]。聚酮化合物是一大類抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲并具免疫抑制劑活性的天然產(chǎn)物。聚酮化合物通常在聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的作用下生成。聚酮合酶可以分為3類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS[2]，其中III型PKS即查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）超家族主要分布于植物界。自從1983年第一個(gè)植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族成員查爾酮合酶基因被克隆以來，植物III型PKS不斷被克隆和鑒定，序列分析表明他們之間氨基酸序列相似性在60%以上，編碼約400個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[3]。Ma等[4]從虎杖中克隆得到一個(gè)III型PKS基因PcPKS1，該基因含有3個(gè)內(nèi)含子，BLAST分析發(fā)現(xiàn)，PcPKS1與其他植物來源的PKS基因具有80%～99%核苷酸序列的相似性[5，6]。體外酶活試驗(yàn)研究表明，PcPKS1是一個(gè)具有查爾酮合酶（CHS）和苯亞甲基丙酮合酶（BAS）活性的雙功能酶[5]，但PcPKS1在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能研究鮮有報(bào)道。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由靶基因同源雙鏈RNA引發(fā)，在動(dòng)植物和真菌中普遍存在序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。按雙鏈RNA（dsRNA）產(chǎn)生途徑將RNAi技術(shù)分為多種，其中以具有反向重復(fù)序列的hpRNA載體結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄過程中形成穩(wěn)定的dsRNA抑制基因表達(dá)的效率較高[7]。RNAi技術(shù)已成為功能基因組學(xué)研究、動(dòng)植物性狀改良和疾病基因治療的強(qiáng)有力工具[8，9]。

虎杖富含芳香族聚酮化合物，存在多種Ⅲ型PKS基因來合成這些復(fù)雜多樣的化合物，深入研究虎杖中聚酮類化合物的生物合成與代謝途徑將為人們更合理地利用虎杖的藥物資源和基因資源提供參考。本研究從反向遺傳學(xué)入手，選取位于PcPKS1基因的編碼區(qū)保守序列（574 bp）和3′端非編碼區(qū)特異序列（209 bp）為目標(biāo)序列，以載體pYLRNAi作為骨架載體，分別構(gòu)建能形成hpRNA結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體，為進(jìn)一步鑒定PcPKS1基因的生物學(xué)功能和虎杖功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 野生虎杖植株由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心提供。

1.1.2 菌株和載體 根癌農(nóng)桿菌LBA4404和潮霉素抗性的雙元表達(dá)載體pYLRNAi由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因組學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體購自TaRaKa公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 虎杖葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 以野生虎杖葉片為材料，采用Trizol法提取總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 干擾片段的選擇 根據(jù)PcPKS1基因的保守區(qū)和特異區(qū)序列分別設(shè)計(jì)2個(gè)干擾片段（圖1），用于后續(xù)2個(gè)RNAi載體的構(gòu)建。將NCBI中PcPKS1基因（登錄號(hào)：EF090266）的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，查找PcPKS1基因的保守區(qū)域，選擇編碼區(qū)605～1179 間長574 bp的序列作為第一個(gè)干擾片段，簡寫為CDS。在3′端非編碼區(qū)選取長209 bp的特異序列作為第二個(gè)干擾片段，簡寫為UTR。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 以表達(dá)載體pYLRNAi為基礎(chǔ)載體（圖2），該載體攜帶強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子和GUS基因內(nèi)含子（250 bp），具有2個(gè)多克隆位點(diǎn)MCS1和MCS2，可用于干擾片段的正反向插入。在正向片段引物兩端分別加上BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，反向片段引物兩端分別加上Mlu Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點(diǎn)。共設(shè)計(jì)4對(duì)引物，引物序列如表1所示。針對(duì)PcPKS1基因編碼區(qū)，設(shè)計(jì)引物CDS-1和CDS-2擴(kuò)增正向干擾片段CDSf，設(shè)計(jì)引物CDS-3和CDS-4擴(kuò)增反向干擾片段CDSr。針對(duì)PcPKS1基因3′端非編碼區(qū)，設(shè)計(jì)引物UTR-1和UTR-2擴(kuò)增正向干擾片段UTRf，設(shè)計(jì)引物UTR-3和UTR-4擴(kuò)增反向干擾片段UTRr。

1.2.4 干擾片段的克隆與測序 采用25 μL反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。將正向、反向片段的PCR產(chǎn)物純化后分別連接pMD18-T載體，將PCR驗(yàn)證正確的陽性重組子進(jìn)行酶切驗(yàn)證并測序。分別將測序正確的重組子命名為pMD18-CDSf、 pMD18-CDSr、 pMD18-UTRf、pMD18-UTRr。

1.2.5 RNAi載體pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR的構(gòu)建

1）RNAi載體pYLRNAi-CDS的構(gòu)建。利用BamHⅠ和Hind Ⅲ分別對(duì)測序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-CDSf和pYLRNAi進(jìn)行雙酶切，用回收的片段作正向連接，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取長出的單菌落進(jìn)行PCR檢測。檢測出的陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，將提取出的質(zhì)粒和測序正確的pMD18-CDSr進(jìn)行MluⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，用回收的片段進(jìn)行反向連接，獲得RNAi載體pYLRNAi-CDS（圖3A），將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的載體pYLRNAi-CDS進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定和酶切鑒定。

2）RNAi載體pYLRNAi-UTR的構(gòu)建。方法同上，最終獲得RNAi載體pYLRNAi-UTR（圖3B）。用CaCl2凍融法將RNA干擾載體pYLRNAi-CDS和 pYLRNAi-UTR分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，用于后期植物轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDS序列的正向片段和反向片段的克隆

以cDNA為模板，用引物CDS-1和CDS-2對(duì)正向片段CDSf進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用CDS-3和CDS-4對(duì)反向片段CDSr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明擴(kuò)增條帶與預(yù)期574 bp的片段大小一致，初步表明已獲得了CDS序列的正向片段和反向片段（圖4）。正向片段CDSf和反向片段CDSr回收純化后分別連接到pMD18-T載體，對(duì)得到的重組質(zhì)粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr進(jìn)行雙酶切鑒定（圖5），均能酶切得到大小約574 bp的片段。測序結(jié)果表明，獲得的CDS序列的正向片段和反向片段是正確的。

2.2 RNAi載體pYLRNAi-CDS的酶切鑒定

分別用BamH Ⅰ+Hind Ⅲ和MluⅠ+Pst Ⅰ將正向片段和反向片段從重組質(zhì)粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr上切下來，先后插入到pYLRNAi載體的內(nèi)含子兩側(cè)，得到RNAi載體pYLRNAi-CDS。首先對(duì)重組質(zhì)粒pYLRNAi-CDS 進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒DNA。將陽性重組質(zhì)粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小574 bp的正義片段；用MluⅠ和Pst Ⅰ酶切則切出大小574 bp的反義片段（圖6A）。將重組質(zhì)粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小約1.4 kb的片段，符合內(nèi)含子（250 bp）加上正義片段和反義片段長度（圖6B）。以上結(jié)果表明，RNAi載體pYLRNAi-CDS構(gòu)建成功。

2.3 UTR序列的正向片段和反向片段的克隆

以cDNA為模板，用引物UTR-1和UTR-2對(duì)正向片段UTRf進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用UTR-3和UTR-4對(duì)反向片段UTRr進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明擴(kuò)增條帶與預(yù)期209 bp的片段大小一致，初步表明已獲得UTR序列的正向片段和反向片段（圖7）。正向片段UTRf和反向片段UTRr回收純化后分別連接到pMD18-T載體上，對(duì)得到的重組質(zhì)粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr進(jìn)行雙酶切鑒定（圖8），均能酶切得到大小約209 bp的片段。測序結(jié)果表明，獲得的UTR序列的正向片段和反向片段是正確的。

2.4 RNAi載體pYLRNAi-UTR的酶切鑒定

分別用BamHⅠ+Hind Ⅲ和Mlu Ⅰ+Pst Ⅰ將正向片段和反向片段從重組質(zhì)粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr上切下來，先后插入到pYLRNAi載體的內(nèi)含子兩側(cè)，得到RNAi載體pYLRNAi-UTR。首先對(duì)重組質(zhì)粒pYLRNAi-UTR進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒DNA。將陽性重組質(zhì)粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小209 bp的正義片段；用MluⅠ和PstⅠ酶切則切出大小209 bp的反義片段（圖9A）。將重組質(zhì)粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小約660 bp的片段（圖9B），符合內(nèi)含子（250 bp）加上正義片段和反義片段長度。以上結(jié)果表明，RNAi載體pYLRNAi-UTR構(gòu)建成功。

3 討論

RNAi載體構(gòu)建過程中，正、反向重復(fù)序列間加一段間隔序列（如內(nèi)含子），在轉(zhuǎn)錄后能形成更加穩(wěn)定的hpRNA結(jié)構(gòu)，顯著提高RNA沉默的效率和強(qiáng)度[10]。在本研究中，選擇了pYLRNAi載體中的GUS基因內(nèi)含子序列作為間隔序列，以利于轉(zhuǎn)錄后的反向重復(fù)序列形成hpRNA。干擾片段的長度影響RNAi的效率，在哺乳動(dòng)物中，表達(dá)的hpRNA雙鏈長度在21～25 nt時(shí)，既能引發(fā)干擾效應(yīng)，又不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。Wesley等[11]研究發(fā)現(xiàn)，植物雙鏈hpRNA長度為98～853 bp的靶基因反向重復(fù)片段均能高效地導(dǎo)致基因沉默。

靶基因的位置也影響RNAi構(gòu)建的效果[12]。一方面，若將靶基因保守區(qū)域包含在干擾片段內(nèi)，就有可能同時(shí)沉默一簇基因，這種同時(shí)沉默多基因家族的特點(diǎn)，使RNAi在植物功能基因組學(xué)研究成為可能[13]；另一方面，選擇非保守區(qū)域作為干擾片段，則會(huì)提高沉默單個(gè)基因的效率和特異性[10]。Fukusaki等[14]以矮牽牛查爾酮合酶ThCHS1為靶基因，分別選擇610 bp的編碼區(qū)保守序列和132 bp的3′端非編碼區(qū)為干擾片段，構(gòu)建了2個(gè)RNA干擾載體CDSi和UTRi，遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示，CDSi轉(zhuǎn)化株系的紫色花色幾乎完全消失，花瓣呈純白色，而UTRi株系的紫色花色只是部分消退，花瓣呈淡紫色，其原因可能是花色由多個(gè)查爾酮合酶基因共同調(diào)控的，3′端非編碼區(qū)與同家族基因的同源性較低，針對(duì)3′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)的RNAi載體UTRi，往往不會(huì)干擾其他基因而是特定干擾ThCHS1基因表達(dá)，因而導(dǎo)致花色只是部分改變。

在本研究中，經(jīng)過序列比對(duì)分析，選取PcPKS1 基因3′端的非編碼區(qū)長為209 bp的特異序列作為干擾區(qū)段，構(gòu)建了載體pYLRNAi-UTR，這樣保證提高了沉默PcPKS1基因的效率和特異性，為研究PcPKS1基因的功能奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，選取PcPKS1基因編碼區(qū)長為574 bp的保守序列作為干擾區(qū)段，構(gòu)建了載體pYLRNAi-CDS，期望沉默虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因家族或查爾酮合酶基因家族，為虎杖功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

查爾酮合酶是Ⅲ型聚酮合酶家族的重要成員。查爾酮合酶基因是個(gè)多功效基因，可以用于花色修飾[15]和種皮色澤調(diào)節(jié)[16]，甚至影響植株的育性[17]或激素運(yùn)輸[18]。雖然體外試驗(yàn)表明虎杖PcPKS1具有查爾酮合酶活性[5]，但目前對(duì)虎杖中查爾酮合酶基因CHS的功能以及該基因在生物合成途徑中的作用了解較少。

4 小結(jié)

本研究基于反向調(diào)控策略，分別以PcPKS1基因的編碼區(qū)保守序列和3′端非編碼區(qū)特異序列為目標(biāo)序列，成功構(gòu)建了以組成型CaMV35S為啟動(dòng)子，以潮霉素抗性為篩選標(biāo)記的RNA干擾表達(dá)載體pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR。

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