溶劑系統(tǒng)對RP—HPLC分離性能的影響

摘要：反相高效液相色譜（RP-HPLC）中所用的溶劑系統(tǒng)是影響其分離性能的重要因素之一。本研究以尿嘧啶、苯酚、萘、芘、聯(lián)苯、1-萘酚、2-萘酚、鄰甲酚為標準樣品，考察了溶劑強度、溶劑極性等對反相色譜分離性能的影響。采用溶劑三角形法優(yōu)化了多組分樣品分離的溶劑體系，得出最佳分離溶劑系統(tǒng)為甲醇/水（1∶1，V/V）。在此條件下，對中藥茶多酚及大黃提取物進行了分離，效果較好。

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜（RP-HPLC）；溶劑系統(tǒng)；溶劑三角形

中圖分類號：O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2226-03

反相高效液相色譜（RP-HPLC）是液相色譜中最常用的模式，廣泛應(yīng)用于化工、制藥、生物工程等領(lǐng)域。RP-HPLC溶劑系統(tǒng)的選擇與優(yōu)化一直是液相色譜領(lǐng)域的熱門研究課題[1，2]。盡管目前在這一方面有很多文獻可供參考，但對于多組分目標物的分析與分離，仍存在很多問題，且有效選擇并優(yōu)化色譜的溶劑系統(tǒng)也十分困難[3-5]。本研究在考察了溶劑系統(tǒng)的強度、極性等參數(shù)對RP-HPLC分離性能影響的基礎(chǔ)上，使用簡便易行的三角形法優(yōu)化多組分體系分離的溶劑體系，進而得出最佳分離溶劑體系，并應(yīng)用于中藥提取物的分離。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-10ATVP高效液相色譜儀配有SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津公司）與N2000色譜數(shù)據(jù)工作站（浙江大學(xué)智達信息工程有限公司）。SB2200超聲儀（上海申波超聲公司）。

所用試劑均為分析純，購于國藥集團。水為去離子水。中藥茶多酚及大黃原料為市售。所有標準樣品質(zhì)量純度不低于95%。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜分析條件 色譜柱為Agilent SB C18柱；流動相為不同比例的反相溶劑體系；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；檢測溫度為25 ℃；進樣體積為2 ？滋L。

1.2.2 標準樣品的配制 以甲醇/水（1∶1，V/V）作溶劑，分別配制如下標準溶液：尿嘧啶（1 mg/mL）、苯酚和2-萘酚（4 mg/mL），其余樣品萘、芘、1-萘酚、鄰甲酚、聯(lián)苯均為2 mg/mL。取等體積各樣品配制多組分混合標準溶液。

1.2.3 不同溶劑體系下混合標準溶液的測定 配制不同溶劑強度的甲醇-水溶劑；配制等強度的甲醇-水、乙腈-水及四氫呋喃-水溶劑；配制相近極性的異丙醇-水、乙腈-水及四氫呋喃-水混合溶劑；分別以上述溶劑為流動相，在“1.2.1”的色譜條件下測定混合標準溶液的保留值。各溶劑比例見結(jié)果與分析部分。

1.2.4 溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化及分離應(yīng)用 采用溶劑三角形法優(yōu)化混合標準溶液的分離效果，具體方法見結(jié)果與討論部分。采用超聲提取大黃及茶多酚原料，過濾得到提取液，在優(yōu)化得到的溶劑體系下，對提取物進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑強度對分離選擇性的影響

圖1為在不同甲醇水體系下，混合標準溶液的色譜圖。隨著強洗脫溶劑強度的改變，所選擇的標準樣品的分離選擇性發(fā)生了很大的變化。增加溶劑中的水的比例，所有樣品分離結(jié)束的時間顯著增加，由甲醇/水（8∶2，V/V）下的22 min增加到甲醇/水（6∶ 4，V/V）下的210 min，但分離效果逐漸改善，甚至樣品中含有的少量未知雜質(zhì)也可有效分離，見圖1c。

2.2 等強度下不同溶劑體系對分離選擇性的影響

圖2為等強度不同洗脫體系下，混合標準溶液的分離色譜圖。所用的溶劑甲醇/水（4∶6，V/V）、乙腈/水（46∶54，V/V）和四氫呋喃/水（33∶67，V/V）強度相同，但由測定結(jié)果可知，不同溶劑對混合標準溶液中5種組分的分離選擇性不同。

2.3 相近極性的不同溶劑體系對分離選擇性的影響

5種組分的混合樣品在相近極性（約為8）的不同溶劑體系下的分離如圖3所示。由測定的色譜圖結(jié)果可知，乙腈/水（51∶49，V/V）作為溶劑分離5種混合標準溶液所用時間最短，8 min內(nèi)即可完成分離。四氫呋喃/水（35∶65，V/V）溶液作為溶劑分離5種混合標準溶液所用時間最長，分離色譜峰峰型也較差。

2.4 溶劑三角形優(yōu)化及實踐應(yīng)用

采用溶劑三角形法尋找適合多組分分離的反相色譜溶劑體系，其選擇溶劑的過程就是在三角形上尋找優(yōu)化的流動相組成，使之達到理想的分離。通?？梢詰?yīng)用能使各峰產(chǎn)生“最好”分離的3種流動相作為一個新三角形的頂點。如此反復(fù)進行試驗，最終得出最好的分離點。在RPLC中最常用的3種溶劑為甲醇、水和乙腈，為此，本試驗使用這3種溶劑作為首次使用的溶劑三角形的頂點，如圖4a所示，分別以圖形中的1、2、3、4點所構(gòu)成的溶劑比例進行試驗，分離5組分混合樣品。定義第i個點的優(yōu)化指標為Zi=a（1，m）=tRm/tR1。式中a為分配系數(shù)比；tR為保留時間，下標m與1分別為最后一個及第一個組分峰的序號；Zi越高，分離效果越好。在上述試驗點下，優(yōu)化指標值如表1所示。由分離結(jié)果可知，第2點的分離效果最好。第二次優(yōu)化以2點、4點和純甲醇為頂點，重新構(gòu)建溶劑三角形，如圖4b所示，分別以圖形中的5、6、7、8點所構(gòu)成的溶劑比例進行試驗，優(yōu)化結(jié)果見表1。第二次優(yōu)化過程得到的指標值也可以通過圖5所示的3D圖反映，該示意圖表明2點的優(yōu)化指標Z2最大，即最優(yōu)點為2點。

在上述優(yōu)化得到的甲醇/水（1∶1，V/V）體系下，分離中藥茶多酚及大黃提取物，由分離結(jié)果（圖6）可知兩種復(fù)雜提取物中主要的活性成分，如大黃素、EGCG及咖啡因均得到了較好的分離。根據(jù)實際需要，還可以變化其他色譜參數(shù)（如流速、梯度洗脫等）來進一步改善分離效果。

3 小結(jié)與討論

本研究測定了RP-HPLC體系中溶劑強度、溶劑極性參數(shù)對分離選擇性的影響，結(jié)果顯示所選擇的標準樣品在不同溶劑中選擇性差異很大。采用溶劑三角形法優(yōu)化混合多組分分離的溶劑體系，簡便易行，得出了最佳分離溶劑系統(tǒng)為甲醇/水（1∶1，V/V）。在此條件下，對中藥茶多酚及大黃提取物的分離效果較好。

參考文獻：

[1] SNYDER L R，CARR P W，RUTAN S C.Solvatochromically based solvent-selectivity triangle[J].Journal of Chromatography，1993，656（1/2）：537-547.

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[3] LI X J， FU Y J， LUO M， et al. Preparative separation of dryofragin and aspidin BB from Dryopteris fragrans extracts by macroporous resin column chromatography[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012（61）：199-206.

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