動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留檢測(cè)方法的優(yōu)化

摘 要：本文以GB/T 20756-2006檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，在試驗(yàn)前處理和上機(jī)測(cè)定方面優(yōu)化了可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測(cè)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣本在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液吹干后，殘?jiān)盟芙?，?jīng)正己烷液分配脫脂后，過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)，采用電噴霧電離負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行測(cè)定。0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L等6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r=0.997 1，方法檢出限確定為0.04 μg/kg，0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg等3個(gè)加標(biāo)試驗(yàn)變異系數(shù)分別為6.45 %、14.38 %、10.34 %，回收率范圍分別為70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～108.00 %，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。通過(guò)回收率和多種食品樣本的實(shí)測(cè)實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于檢測(cè)可食動(dòng)物肌肉、肝臟以及水產(chǎn)品中的氯霉素殘留。

關(guān)鍵詞：氯霉素；檢測(cè)方法；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2015）07-0066-03

氯霉素是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素，白色針狀或微帶黃綠色的針狀、長(zhǎng)片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味苦，在甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇中易溶，在干燥時(shí)穩(wěn)定，在弱酸性和中性溶液中較安定，煮沸也不見(jiàn)分解，遇堿類(lèi)易失效，屬抑菌性廣譜抗生素。敏感菌有腸桿菌科細(xì)菌及炭疽桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、李斯特氏菌等；衣原體、鉤端螺旋體、立克次體也對(duì)本品敏感。用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、布氏桿菌、肺炎球菌等所引起感染的抗菌作用機(jī)制是與核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成。

氯霉素對(duì)造血系統(tǒng)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。由于氯霉素引發(fā)的再生障礙性貧血是非劑量依賴(lài)的，美國(guó)FDA認(rèn)為：不可能通過(guò)建立允許殘留量和休藥期來(lái)控制氯霉素殘留的危害。也就是說(shuō)，氯霉素的殘留量不論為多少都可認(rèn)為對(duì)人體健康是有害的。近年來(lái)，鑒于氯霉素對(duì)公眾健康可能造成的危害問(wèn)題日益嚴(yán)重，世界各國(guó)和組織紛紛加強(qiáng)了對(duì)食品中氯霉素殘留的控制。2002年年初起，動(dòng)物源性食品氯霉素殘留問(wèn)題給中國(guó)的食品出口帶來(lái)極大的影響。歐盟宣布：“自2002年l月31日起禁止從中國(guó)進(jìn)口供人類(lèi)消費(fèi)或用作動(dòng)物飼料的動(dòng)物源性產(chǎn)品?！笔刮覈?guó)當(dāng)年在歐盟市場(chǎng)丟掉13萬(wàn)t水產(chǎn)品的市場(chǎng)份額和造成6億多美元的經(jīng)濟(jì)損失。同年2月7日，英國(guó)以氯霉素超標(biāo)為由停止銷(xiāo)售中國(guó)蜂蜜。歐盟其他國(guó)家紛紛效仿，以抗生素殘留超標(biāo)為由將中國(guó)蜂蜜擋在國(guó)門(mén)之外，同時(shí)美國(guó)、日本、加拿大等其他國(guó)家相繼提高了對(duì)中國(guó)動(dòng)物源性食品中藥物殘留的檢出限量。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年4月9日頒布了《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告 第193號(hào)》，其中食品生產(chǎn)用動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單中就包含了氯霉素及其鹽、酯制劑。而氯霉素殘留的檢測(cè)方法目前報(bào)道的有很多，主要有以下幾種：金標(biāo)試紙條法、酶聯(lián)免疫分析法、放射性免疫分析法、微生物法、氣相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等等。

其中，高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法具有靈敏度較高、可準(zhǔn)確定性定量、操作更方便、受環(huán)境影響較小等優(yōu)點(diǎn)，如在GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中均使用此方法，氯霉素的檢出限可達(dá)到0.1 μg/kg。經(jīng)過(guò)不斷探索和試驗(yàn)，我們?cè)凇禛B/T 20756-2006 可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的基礎(chǔ)上，對(duì)其前處理操作及儀器參數(shù)方面都進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下：

1 儀器與主要試劑

1.1 所用儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀Waters AcQuity UPLC / XoVo TQMS，百位電子天平，離心機(jī)，氮吹儀。

1.2 主要試劑

氯霉素及氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），乙酸乙酯（色譜純），氨水，無(wú)水硫酸鈉（經(jīng)600 ℃、3 h烘干）。正己烷（色譜純）濾膜（津騰：0.22 μm，有機(jī)相），二次蒸餾水等。

2 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取5 g試樣，精確至0.01 g。置于50 mL離心管中，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液（氯霉素-D5），加入20 mL乙酸乙酯，0.5 mL氨水，5 g無(wú)水硫酸鈉渦旋60 s，震蕩15 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液4 mL，45 ℃氮?dú)獯蹈伞?1 mL水復(fù)溶，加4 mL正己烷，渦旋30 s，以5 000 r/min離心3 min，去上層正己烷，再重復(fù)一次。過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)測(cè)定。

3 上機(jī)測(cè)定

液相色譜及質(zhì)譜條件：

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）或相當(dāng)者；

柱溫：40 ℃；

流動(dòng)相：甲醇+水（40+60）；

流速：0.300 mL/min；

進(jìn)樣量：5.0 μL；

離子源：電噴霧離子源；

掃描方式：負(fù)離子掃描；

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；

電噴霧電壓：-1 750 V；

輔助氣溫度：500 ℃；

定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、采集時(shí)間、去簇電壓及碰撞能量見(jiàn)表1。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L），待儀器基線(xiàn)穩(wěn)定后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1），其相關(guān)系數(shù)r=0.997 1。

4.2 方法檢出限確定

以空白雞肉樣本為基質(zhì)，添加濃度為0.1 μg/kg，按照上述方法全過(guò)程進(jìn)行預(yù)處理和測(cè)定，平行樣本n=7，根據(jù)各樣本檢測(cè)值（0.09 μg/kg、0.09 μg/kg、0.10 μg/kg， 0.10 μg/kg、0.10 μg/kg、0.08 μg/kg、0.11 μg/kg），計(jì)算出平均值X（0.096 μg/kg）及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb（0.012 9），當(dāng)被分析物的回收率在70 %～120 %之間時(shí)，可計(jì)算檢出限為0.04 μg/kg。計(jì)算公式如下：

檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X

其中：k為置信因子，一般取3。

4.3 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

以空白雞肉樣本為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg（圖2）。將加標(biāo)樣本和空白樣本按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2、表3和表4。

5 結(jié)果與結(jié)論

經(jīng)過(guò)60次的反復(fù)比較試驗(yàn)，與《GB/T 20756-2006》相比較，在前處理步驟方面：本方法把勻質(zhì)提取步驟代之以15 min充分振蕩提取，同樣可滿(mǎn)足原方法要求。在振蕩充分的前提下，由于提取液最終只需分取五分之一，則提取過(guò)程只需一次即可滿(mǎn)足原方法要求。在凈化方面，去脂的過(guò)程不在于正己烷量的多少，而在于凈化的次數(shù)，1 mL正己烷重復(fù)一次即可。這些優(yōu)化過(guò)程，既能滿(mǎn)足原方法要求，又節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間及試劑耗材。

優(yōu)化參數(shù)如下：一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r=0.997 1；方法檢出限確定為0.04 μg/kg，亦能達(dá)到GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中氯霉素的檢出限；0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加標(biāo)試驗(yàn)變異系數(shù)分別為 6.45 %、14.38 %、10.34 %， 0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～ 108.00 %，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。通過(guò)回收率和多種食品樣本的60次實(shí)測(cè)實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于檢測(cè)可食動(dòng)物肌肉、肝臟以及水產(chǎn)品中的氯霉素殘留。□□

參考文獻(xiàn)：（6篇，略）