一株拮抗椰子莖瀉血病菌的鏈霉菌鑒定

牛曉慶 余鳳玉 宋薇薇 唐慶華 朱輝 覃偉權(quán)

摘 ?要 ?從文昌椰子園土壤分離篩選到一株對(duì)椰子瀉血病菌奇異長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis paradoxa）有良好抑制效果的放線菌FXJ-258，對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。結(jié)果表明：該菌孢子方形至長(zhǎng)圓形，表面光滑，在高氏培養(yǎng)基上，氣絲初期白色，隨著時(shí)間漸變?yōu)闇\灰色，基絲無(wú)鑒別色素，無(wú)可溶性色素;能利用L-阿拉伯糖，D-半乳糖， D-葡萄糖，D-甘露糖，D-木糖，D-核糖，L-鼠李糖等碳源，不能利用D-果糖，肌醇，蔗糖，水楊苷等。以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了菌株FXJ-258的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其與模式鏈霉菌株的16S rDNA序列的同源性為99.64%，初步將該菌株鑒定為Streptomyces murinus。

關(guān)鍵詞 ?鼠灰鏈霉菌;篩選;椰子瀉血病;拮抗菌

中圖分類(lèi)號(hào) ?S432.4 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Identification of a Streptomyces Strain Against Coconut Stem

Bleeding Disease Caused by Ceratocystis Paradoxa

NIU Xiaoqing， YU Fengyu， SONG Weiwei， TANG Qinghua，

ZHU Hui， QIN Weiquan*

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan

Key Laboratory for Biology of Tropical Oil Crops， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract ?A streptomyces strain named FXJ-258 against stem bleeding disease caused by Ceratocystis paradoxa was isolated from soil in Wenchang coconut garden. The morphological characteristics， cultural characteristics， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequences analysis of Streptomyces FXJ-258 were studied. The result showed that，the spores of FXJ-258 were quadrate or ovale， smooth-surfaced. On Gauses Synthetic Agar medium（GSA）， the substrate mycelia of FXJ-258 was colored that couldnt be identified， the clone of FXJ-258 was white when it started growing on GSA， after matured， the aerial mycelia of FXJ-258 became gray gradually， couldn't produce soluble pigment on GSA medium. FXJ-258 grew better on medium with L-arabinose， D-galactose， D-glucose， D-mannitol， D-xylose， D-ribose， L-rhamnose as C source; D-fructose， inositol， salicin and sucrose were not available. Besides， a phylogenetic tree was constructed by comparing with the published 16S rDNA sequence of the related species; ITS sequence analysis revealed 99.64% sequence similarity with Streptomyces murinus. Thus， FXJ-258 was preliminarily classed to S. murinus.

Key words ?Streptomyces murinus; Screen; Stem bleeding disease of coconut; Antagonistic

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.021

自2009年以來(lái)，海南省椰子莖瀉血?。⊿tem Bleeding Disease of Coconut）發(fā)病面積逐年增大，現(xiàn)已成為椰子主要病害之一，其病原是奇異長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis paradoxa）。該病害主要危害椰子莖部，病灶部位流出血色液體，干燥后成鐵銹色（圖1），當(dāng)遇到連續(xù)陰雨天氣，嚴(yán)重時(shí)植物組織會(huì)壞死，造成莖干腐爛（圖2），直至植株死亡。目前生物防治手段是防治該病害的主要途徑。印度在該病的生物防治方面做了一些研究，Srinivasulu等[1]報(bào)道綠色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（T. harzianum）、哈氏木霉（T. hamatum）對(duì)奇異根串珠霉菌（T. paradoxa）有極強(qiáng)的抑制效果;Gowda等[2]報(bào)道蒜（Allium sativum Linn.）提取物對(duì)奇異根串珠霉菌（T. paradoxa）也有強(qiáng)烈的抑制作用。鏈霉菌也是一類(lèi)重要的生防菌，能產(chǎn)生多種農(nóng)用抗生素，較化學(xué)農(nóng)藥，具有選擇性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性、可再生、環(huán)境兼容性好、生產(chǎn)原料廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已成為無(wú)公害農(nóng)藥發(fā)展的方向[3]。筆者從椰子林、紅樹(shù)林土壤分離到大量菌株，從中篩選到一株針對(duì)奇異長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis paradoxa）防治效果較好的鏈霉菌，編號(hào)為FXJ-258。本研究對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性研究及16S rDNA序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定，該菌FXJ-258室內(nèi)防治奇異長(zhǎng)喙殼菌的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外尚屬首次。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菌株來(lái)源：菌株FXJ-258分離自椰子林土壤，保存于椰子研究所病理實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基：甘油硝酸鹽素瓊脂、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂、葡糖天冬素瓊脂、甘油天冬素瓊脂、酵母麥芽精瓊脂、燕麥粉瓊脂、酪氨酸瓊脂、高氏一號(hào)培養(yǎng)基（GSA）、高氏液體培養(yǎng)基（GS）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固、黑色素產(chǎn)生、硝酸鹽還原、纖維素分解、碳源利用等，配置方法見(jiàn)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[4]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?拮抗菌的篩選 ? 采用平板對(duì)峙法，篩選拮抗菌株。在PDA平板中央接上椰子瀉血病菌菌餅（Φ=6 mm），菌餅兩端接上放線菌塊，有抑菌帶出現(xiàn)，視為有拮抗作用。抑菌圈大小測(cè)定，采用十字交叉法，在平板（Φ=9 cm）四周等距離接4株病原菌餅（Φ=6 mm），平板中央接放線菌，于28 ℃培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次。以中央只接病原菌，不接放線菌平板為對(duì)照。待對(duì)照菌株長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，測(cè)量抑菌圈直徑，觀察放線菌的抑菌效果。

1.2.2 ?鏈霉菌菌株FXJ-258的形態(tài)學(xué)、生理生化特性研究 ? 選取篩選到的拮抗菌株FXJ-258，采取插片法，利用顯微鏡觀察菌絲形態(tài);根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[5]推薦的培養(yǎng)基，觀察基內(nèi)菌絲，氣生菌絲和可溶性色素的顏色等表觀特征， 3次重復(fù);配制明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固、黑色素產(chǎn)生、硝酸鹽還原、纖解、碳源利用等固體、液體培養(yǎng)基，測(cè)定菌株FXJ-258的生理生化特性，3次重復(fù)。

1.2.3 ?鏈霉菌菌株FXJ-258 16 S rDNA序列分析

參照Kieser等[5]方法提取該菌株基因組DNA。選用鏈霉菌16 S rDNA的通用引物：Primer A：CATTCACGGAGAGTTTGATCC和Primer B：AGAA

AGGAGGTGATCCAGCC進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的16 S rDNA序列與GenBank中的已有序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，按照16 S rDNA序列同源性高低，選取模式菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?拮抗菌的分離篩選

篩選結(jié)果顯示FXJ-258拮抗效果較好，抑菌圈直徑達(dá)到3.5 cm。圖3為拮抗效果圖，可見(jiàn)產(chǎn)生的抑菌圈與菌絲的界線明顯，光滑，無(wú)菌絲擴(kuò)展出來(lái)。

2.2 ?鏈霉菌菌株FXJ-258形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定

該菌在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，灰白色，圓形，平坦，如圖4所示，在液體高氏一號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)28 ℃，150 rpm，搖7 d，菌體圓球形，光滑（圖5）。 該菌孢子方形至長(zhǎng)圓形，表面光滑或帶疣，菌絲有分支多呈銳角或直角（圖6）。

FXJ-258生理生化結(jié)果顯示：菌株FXJ-258能使明膠稍微液化，牛奶凝固和胨化可疑，淀粉水解能力弱，不能水解纖維素，不產(chǎn)生H2S和酪氨酸酶和黑色素，有硝酸鹽還原反應(yīng)，不形成黑色素;FXJ-258在各培養(yǎng)基上的孢子絲生長(zhǎng)情況及可溶性色素情況見(jiàn)表1，表1同時(shí)顯示了與近緣種Streptomyces murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus的比較結(jié)果[6]。

FXJ-258能利用L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-木糖，D-核糖，L-鼠李糖等碳源，不能利用D-果糖，水楊苷、蔗糖、肌醇等多種物質(zhì)，詳見(jiàn)表2，表2同時(shí)顯示了FXJ-258與近緣種Streptomyces murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus的比較結(jié)果。

2.3 ?鏈霉菌菌株FXJ-258 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

菌株FXJ-258 16S rDNA PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序，共1 320 bp，在GenBank中，與已有序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析。結(jié)果表明：FXJ-258與S. murinus，S. costaricanus，S. graminearus，S. griseofuscus序列同源性最高，相似度高達(dá)99.64%。根據(jù)16S rDNA序列同源性高低選擇模式菌株的序列，利用Megalign子軟件做列陣分析，用Phylogenetictree命令做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖7）。從圖7中可以看出，菌株 FXJ-258與S. costaricanus，S. graminearus，S. murinus，S. griseofuscus歸為一簇，親緣關(guān)系比較近。

綜上所述，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，可將菌株FXJ-258初步確定為老鼠灰鏈霉菌S. murinus。進(jìn)一步確定有待于做Western-blot 雜交實(shí)驗(yàn)。

3 ?討論與結(jié)論

目前，椰子莖瀉血病已成為海南椰子的重要病害，近年來(lái)發(fā)展迅速，嚴(yán)重影響了椰樹(shù)的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。當(dāng)前還沒(méi)有長(zhǎng)期有效的化學(xué)農(nóng)藥能彌補(bǔ)因此病害而造成的損失，抗病品種和生物防治也剛剛起步。從生態(tài)安全角度出發(fā)，生物防治具有更廣闊的前景，其中拮抗放線菌是具有巨大研究?jī)r(jià)值的一類(lèi)微生物，其應(yīng)用是生物防治必備的手段之一。海南具有得天獨(dú)厚的地理環(huán)境，微生物資源豐富、種類(lèi)繁多，為放線菌的篩選提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，迄今已知的抗生素中有2/3由放線菌產(chǎn)生，利用放線菌的抗生素制備的農(nóng)藥已經(jīng)成為無(wú)公害農(nóng)藥的主體[7]。據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道，以奇異長(zhǎng)喙殼菌（Ceratocystis paradoxa）為靶標(biāo)而篩選出的拮抗放線菌為淺灰鏈霉菌（Streptomyces griseolus）[8]，其他拮抗菌株尚未見(jiàn)鑒定研究。

本研究通過(guò)菌株16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)等分子生物學(xué)方法對(duì)FXJ-258進(jìn)行了分類(lèi)鑒定，結(jié)果顯示，F(xiàn)XJ-258屬于Streptomyces costaricanus，S. graminearus，S. murinus，S. griseofuscus中的一種，因此要進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征和生理生化特性等方面的異同方可將其初步鑒定到種。該菌在甘油天冬素瓊脂，酵母麥芽精瓊脂，燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基上，氣絲灰色至灰紅色，基絲無(wú)鑒別色素，可溶性色素為黃色。在無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂、葡萄糖天冬素瓊脂上，氣絲粉狀至灰紅色，基絲為黃色;在馬鈴薯塊上，氣絲灰色，基絲正面為黃色，可溶性色素?zé)o可鑒別色素;能使明膠稍微液化，不確定是否能使牛奶凝固和胨化，淀粉水解能力弱，不能水解纖維素，不產(chǎn)生H2S和酪氨酸酶和黑色素，有硝酸鹽還原反應(yīng)，不形成黑色素，能利用L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露醇，L-鼠李糖，D-木糖，棉籽糖，D-核糖等多種碳源，不能利用D-果糖，蔗糖，水楊苷等碳源。

將FXJ-258的培養(yǎng)情況與4種模式菌株S. costaricanus，S. graminearus、S. murinus，S. griseofuscus比較可知：在葡萄糖天冬素瓊脂上，哥斯達(dá)黎加鏈霉菌S. costaricanus氣絲黃灰褐色，反面鮮黃色;灰褐鏈霉菌S. griseofuscus 呈現(xiàn)灰色，禾粟鏈霉菌S. graminearus氣絲白色帶黃色調(diào)，S. murinus呈現(xiàn)淺灰色[9]，F(xiàn)XJ-258亦呈現(xiàn)淺灰色與S. murinus保持一致。

將FXJ-258的碳源利用情況與上述4種模式菌株比較可知：FXJ-258能利用棉籽糖，L-阿拉伯糖， D-葡萄糖，D-甘露醇，D-木糖，不利用蔗糖、水楊苷等與S. murinus一致;S. costaricanus不利用棉籽糖、L-阿拉伯糖與FXJ-258不同;S. graminearus不利用阿拉伯糖，利用蔗糖情況可疑，不確定是否利用水楊苷與FXJ-258不同;灰褐鏈霉菌S. griseofuscus能利用肌醇，利用棉籽糖可疑與FXJ-258不同;綜上知，經(jīng)過(guò)碳源利用情況比較和培養(yǎng)特性比較結(jié)果，可將FXJ-258初步鑒定為S. murinus。關(guān)于鼠灰鏈霉菌S. murinus拮抗椰子瀉血病菌奇異長(zhǎng)喙殼菌Ceratocystis paradoxa的研究在國(guó)內(nèi)外均屬于首次報(bào)道。下一步筆者將繼續(xù)針對(duì)此菌做較深入的探索，比如拮抗穩(wěn)定性、抑菌機(jī)理、生物安全性等方面的研究，進(jìn)而做田間防效實(shí)驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)出對(duì)奇異長(zhǎng)喙殼菌有很好防治效果的生防菌劑打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為綠色寶島形象樹(shù)的美麗健康及高產(chǎn)貢獻(xiàn)綿薄之力。

參考文獻(xiàn)

[1] Srinivasulu B， Vijay K K K， Lakshmi M V， et al. Biointensive IDM approach against basal stem rot and stem bleeding diseases of coconut[J]. Journal of Plantation Crops， 2006， 34（3）： 502-507.

[2] Gowda P V， NambiarK K N. Antifungal activity of garlic（Allium sativum Linn.）von Hohnel， the pathogen of stem bleeding disease of coconut[J]. Journal of Plantation Crops， 2006， 34（3）： 472-475.

[3] 文采藝， 張 ?磊， 李洪連. 農(nóng)用抗生素S024的作用機(jī)理的初步研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007（7）： 53-57.

[4] 中國(guó)科學(xué)院微生物所放線菌分類(lèi)組. 鏈霉菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1975.

[5] Kieser T， Bibb M J， Buttner M J， et al. Practical streptomyces genetics[M]. Norwich： John Innes Foundation， 2000： 162-170.

[6] Esnard J， Potter T L， Zuckerman B M. Streptomyces costaricanus sp. Nov.， isolated from nematode-suppressive soil[J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（4）： 775-779.

[7] 展麗然， 張克誠(chéng)， 冉隆賢， 等. 農(nóng)用抗生素篩選模型的發(fā)展概述[J]. 微生物學(xué)雜志， 2008， 28（6）： 91-94.

[8] 牛曉慶， 余鳳玉， 林 ?茜， 等. 椰子林土壤放線菌的分離及拮抗椰子瀉血病菌的鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 33（1）：1-7.

[9] 盧 ?娟， 夏啟玉， 孫建波， 等. 一株拮抗香蕉枯萎病菌的鏈霉菌分離和鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2011， 32（2）： 278-282.