貓爪草體外抗結(jié)核作用研究

楊堃　鄧可眾　李漢興　熊英

摘要 [目的]觀察3種貓爪草的醇提物及貓爪草各不同極性部位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌株和耐藥菌株的體外抑菌效果。[方法]采用絕對(duì)濃度法，進(jìn)行3種貓爪草70%乙醇提取物和貓爪草醇提物經(jīng)萃取分離得到的4個(gè)極性不同部位對(duì)結(jié)核分支桿菌（H37RV）和耐藥菌株的藥物敏感試驗(yàn)。[結(jié)果]3種貓爪草（4 mg/ml）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株均有抑菌作用，且石油醚萃取部位抑菌濃度最低為2 mg/ml。[結(jié)論]貓爪草具有明顯的體外抗耐藥結(jié)核作用，以石油醚萃取部位抑菌效果最佳。

關(guān)鍵詞 貓爪草；H37RV；耐藥結(jié)核

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-076-02

近年來由于耐藥及多重耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病呈逐漸上升趨勢(shì)并對(duì)現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)，同時(shí)，從化學(xué)合成物中尋找有效藥物的難度日益增大，故而從我國(guó)豐富的植物資源中尋找有效的抗結(jié)核藥物，已引起越來越廣泛的重視。

貓爪草為毛茛科毛茛屬植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根[1]，原為無名野草，是20世紀(jì)50年代河南省信陽地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的一種草藥，《中華人民共和國(guó)藥典》自1977年版開始，每版均予收載。臨床上主要用于治療頸淋巴結(jié)核、肺結(jié)核、腮腺炎[2-6]，還可用于治療急慢性咽炎[7]，目前臨床上用于治療結(jié)核及耐藥性結(jié)核的中成藥有貓爪草膠囊（為單味貓爪草藥材的提取物）以及以貓爪草為主藥的金盾膠囊、療肺散、肺得潤(rùn)[8-10]等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道貓爪草治療結(jié)核病具有療效好、無不良反應(yīng)、遠(yuǎn)期療效穩(wěn)定、不產(chǎn)生耐藥性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)[8-10]。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在江西樟樹藥材市場(chǎng)上市售的貓爪草藥材至少有大小不同的3種類型，為此，筆者采用絕對(duì)濃度法對(duì)3種貓爪草70%乙醇提取物及其各不同極性部位的體外抗耐藥結(jié)核作用進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株為結(jié)核分枝桿菌H37RV（由江西省疾控中心提供）；臨床分離耐藥性菌株包括單獨(dú)耐異煙肼菌株（耐INH）、雙耐藥性菌株（耐異煙肼和利福平，即耐INH + RFP），由南昌市第三人民醫(yī)院臨床病例分離培養(yǎng)；二甲基亞砜（重慶化工試劑廠）、天門冬素（北京三藥科技開發(fā)有限公司）、枸櫞酸鎂（成都科龍化工試劑廠）、磷酸二氫鉀（成都科龍化工試劑廠）、硫酸鎂（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）、甘油（成都科龍化工試劑廠）、孔雀綠（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），均為分析純；純化水。3種不同的貓爪草藥材于2011年12月購(gòu)自江西樟樹藥材市場(chǎng)（批號(hào)RT1001、1002、1003），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定為R.ternatus Thunb.的干燥塊根。RT1001：本品由8～30個(gè)紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長(zhǎng)8～20 mm，直徑8～15 mm，頂端有黃褐色殘莖或莖痕。表面黃褐色或灰黃色，微有縱皺紋，并有點(diǎn)狀須根痕和殘留須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面類白色或黃白色，空心或?qū)嵭?，粉性。氣微，味微甘。RT1002：本品由7～25個(gè)紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長(zhǎng)3～10 mm，直徑4～8 mm，其余的同藥材RT1001。RT1003：本品由5～15個(gè)紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長(zhǎng)3～10 mm，直徑2～8 mm，其余的同藥材RT1001。

1.2 方法

1.2.1 3種貓爪草醇提物抗耐藥結(jié)核的研究。

1.2.1.1 樣品的配制。3種貓爪草粉碎，分別稱取50 g，采用70%乙醇8倍量加熱回流提取2次，2次合并，回收乙醇溶液得浸膏備用。

1.2.1.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基的制備。將天門冬素3.6 g、枸櫞酸鎂0.6 g、KH2PO4 2.4 g、MgSO4·7H2O 0.24 g、甘油12 ml、水600 ml、新鮮全雞蛋1 000 ml、2%孔雀綠20 ml等各成分加入600 ml水中，加溫溶解，待冷卻后，加入全雞蛋1 000 ml，再加入2% 孔雀綠20 ml，待用。

1.2.1.3 含藥結(jié)核菌培養(yǎng)基的制備。取“1.2.1.1”提取物1 g，加入10 ml DMSO（二甲基亞砜）溶劑溶解，即得濃度為100 mg/ml的原液；然后取原液2 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基48 ml放入試管中，即得濃度為4 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；取原液0.5 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基49.5 ml 放入試管中，即得濃度為1 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；取原液0.2 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基49.8 ml放入試管中，即得濃度為0.4 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；將制備好的含藥培養(yǎng)基放入蒸汽恒溫箱85 ℃，50 min滅菌，同時(shí)還制備空白對(duì)照組培養(yǎng)基（不含任何藥物的培養(yǎng)基）及陽性對(duì)照組培養(yǎng)基（單含異煙肼INH 1 μg/ml及單含利福平RFP 50 μg/ml）。

1.2.1.4 接種。分別挑取已培養(yǎng)H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌落各1個(gè)，放入研磨管內(nèi)，研磨成糊狀后，用生理鹽水（無菌）稀釋并用硫酸鋇比濁管比濁成（1 mg/ml）的菌液，再稀釋至10-2 mg/ml，用滅菌吸管準(zhǔn)確吸取菌液0.1 ml分別接種于“1.2.1.3”含藥和不含藥培養(yǎng)基的斜面，同時(shí)接種于單含INH及單含RFP培養(yǎng)基的斜面作為對(duì)照。

1.2.1.5 培養(yǎng)。上述所有的培養(yǎng)基均置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4周后觀察。

1.2.2 貓爪草4種不同極性部位抗耐藥結(jié)核的試驗(yàn)研究。

1.2.2.1 樣品的配制。取貓爪草（批號(hào)RT1001）干燥塊根粉碎，稱取50 g，分別用95%、65%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至無醇味的總浸膏，將以上得到的總浸膏懸溶解于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種溶劑分別萃取，將各自萃取所得液減壓濃縮得石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水層部分浸膏。

1.2.2.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基的制備。同“1.2.1.2”。

1.2.2.3 含藥結(jié)核菌培養(yǎng)基的制備。取“1.2.2.1”提取物1 g，加入10 ml DMSO（二甲基亞砜）溶劑溶解，即得濃度為100 mg/ml的原液；然后取原液2.5 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基47.5 ml入試管中，即得濃度為5.0 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；取原液1.0 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基49.0 ml放入試管中，即得濃度為2 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；取原液0.5 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結(jié)核培養(yǎng)基49.5 ml放入試管中，即得濃度為1.0 mg/ml的含藥培養(yǎng)基；將制備好的含藥培養(yǎng)基放入蒸汽恒溫箱85 ℃，50 min滅菌，同時(shí)還制備空白對(duì)照組培養(yǎng)基（不含任何藥物的培養(yǎng)基）及陽性對(duì)照組培養(yǎng)基（單含異煙肼INH 1 μg/ml及單含利福平RFP 50 μg/ml）。

1.2.2.4 接種與培養(yǎng)。均同“1.2.1.4”、“1.2.1.5”。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種貓爪草醇提物抗耐藥結(jié)核的試驗(yàn)研究 由表1可見，市場(chǎng)上3種大小不一的貓爪草醇提物在4.0 mg/ml濃度下對(duì)H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌株均具有明顯的抑制作用，未見菌落生長(zhǎng)；在1.0和0.4 mg/ml低濃度下，抑制作用不明顯。

2.2 貓爪草4種不同極性部位抗耐藥結(jié)核的試驗(yàn)研究 從表2可以看出，同一批貓爪草的4種不同極性部位抗耐藥結(jié)核以石油醚萃取物效果最好，其濃度為2 mg/ml時(shí)即能明顯抑制H37RV、耐INH、耐INH+RFP的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用絕對(duì)濃度法，對(duì)市場(chǎng)上3種大小不一的貓爪草及貓爪草醇提物經(jīng)萃取分離得到的4個(gè)極性不同的萃取部位進(jìn)行了體外抗耐藥結(jié)核作用的研究，結(jié)果表明，3種大小不一的貓爪草醇提取物在4 mg/ml濃度下對(duì)H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌株均具有明顯的抑制作用，未見菌落生長(zhǎng)；同一貓爪草的不同極性部位萃取物以石油醚萃取物效果最好，藥物濃度為2 mg/ml時(shí)能明顯抑制雙耐藥菌株的生長(zhǎng)。該試驗(yàn)充分證明了中藥貓爪草具有明顯的體外抗結(jié)核桿菌和耐藥菌株的作用，下一步的工作擬以抗耐藥結(jié)核活性為導(dǎo)向，采用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)貓爪草進(jìn)一步分離純化，以充分利用和開發(fā)這一植物資源。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：300.

[2] 張鳳池，石詳奎，劉成永.貓爪草膠囊對(duì)頸淋巴結(jié)核的治療效果觀察[J].抗感染藥學(xué)，2006，3（1）：23-24.

[3] 王衛(wèi)陽.貓爪草膠囊聯(lián)合常規(guī)抗結(jié)核藥物治療頸淋巴結(jié)核的療效觀察[J].安徽醫(yī)藥，2007，11（3）：212.

[4] 曾鶴軍.貓爪草膠囊治療頸部淋巴結(jié)結(jié)核療效分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003，14（4）：248-249.

[5] 張志軍，裴桂芬.貓爪草膠囊治療淋巴結(jié)結(jié)核60例療效分析[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2007（2）：26-27.

[6] 楊建華.貓爪草膠囊治療小兒頸部淋巴結(jié)結(jié)核療效分析[J].河北醫(yī)藥，2006，28（11）：1048-1049.

[7] 黎新榮，溫寶儀，陳惠君.復(fù)方貓爪草喉片的制備與質(zhì)量分析[J].中藥材，1995，18（7）：363-364.

[8] 梁紅文，王法權(quán)，蘇明.含貓爪草膠囊化療方案治療耐藥肺結(jié)核112例療效分析[J].中原醫(yī)刊，2007，34（14）：73-74.

[9] 茅蓉，杜文良.貓爪草膠囊在抗肺結(jié)核短程化療中的應(yīng)用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，15（4）：239.

[10] 王愛武，田景奎，袁久榮，等.中藥貓爪草的研究概況與展望[J].中國(guó)藥業(yè)，2005，14（1）：25-27.