湖北利川黃連HPLC指紋圖譜研究

張亮　龍瀾　楊永康　李亞杰　李紅英　田騰飛

摘要 [目的]建立湖北利川黃連的高效液相色譜指紋圖譜， 為評價其質(zhì)量提供科學(xué)、有效的方法。[方法]采用C18色譜柱， 乙腈-0.05 mol/L磷酸梯度洗脫； 流速為1.0 ml/min， 檢測波長354 nm；柱溫為35 ℃。[結(jié)果]對湖北利川黃連10批次藥材進(jìn)行指紋圖譜分析， 通過HPLC技術(shù)指認(rèn)指紋圖譜共有12個共有峰，共有峰總面積92.31%～95.67%，相似度0.940～0.986。乙腈-0.05 mol/L磷酸進(jìn)行梯度洗脫最佳。[結(jié)論]該方法具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，10個批次的黃連樣品生成的指紋圖譜可作為湖北利川黃連的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

關(guān)鍵詞 黃連；指紋圖譜；HPLC

中圖分類號 S188；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-030-02

黃連（Coptis Chinensis）屬毛茛科植物，藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要用于小兒驚癇、瀉痢、骨蒸癆熱、黃疸等癥[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃連中含有小檗堿、巴馬丁、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿和及少量的有機(jī)酸等[3-4]。目前，用于黃連指紋圖譜的分析方法有毛細(xì)管電泳法、紅外光譜法、高效液相色譜法、核磁氫譜法等[5-8]。筆者采用高效液相色譜法，對湖北利川黃連進(jìn)行分析，并制定出湖北利川黃連的指紋圖譜，為黃連藥材的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃連樣品來源見表1。

1.2 儀器與試劑 戴安液相3000；KQ-250D型超聲波清洗器；鹽酸小檗堿對照品（上海源葉生物科技有限公司），色譜乙腈，去離子水，甲醇、磷酸二氫鉀、鹽酸等試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。

檢測波長：354 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：25 ℃，柱子：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。黃連指紋圖譜梯度流動相見表2。

1.3.2 對照品溶液的制備。取鹽酸小檗堿對照品適量，用甲醇分別配制成含鹽酸小檗堿100 μg/ml的對照品溶液。

1.3.3

供試品的制備。精確稱取黃連藥材（粉碎過4號篩） 0.50 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，分別精密加入甲醇∶鹽酸（100∶1，V/V）30 ml，超聲波提取40 min，過濾，定容于50 ml容量瓶中，搖勻，作為供試品。

1.3.4 指紋圖譜的制備方法。精密吸取對照溶液和和供試品溶液各20 μl注入液相色譜儀中，按“1.3.1”的色譜條件測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度

按照“1.3.1”的色譜條件連續(xù)進(jìn)同一供試品溶液5次，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結(jié)果12個共有峰的保留時間RSD為0.43%～1.25%，主要色譜峰的相對峰面積RSD為0.61%～1.38%。

2.2 穩(wěn)定性

取同一供試品溶液，每2 h測定一次，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結(jié)果12個共有峰的保留時間和主要色譜峰的相對峰面積基本一致，RSD分別為0.52%～1.47%、0.71%～1.89%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性

取黃連藥材5份，按照“1.3.3”的方法平行制備5份供試品，依法測定，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結(jié)果12個共有峰的保留時間和主要色譜峰的相對峰面積基本一致，RSD分別為0.63%～1.37%，0.58%～1.61%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.4 黃連指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰的確定。取表1中的10批黃連藥材，按“1.3.3”的方法制備供試品溶液進(jìn)樣測定。鹽酸小檗堿對照品和10批黃連藥材指紋色譜圖見圖1、2。比較其色譜圖，得到12個共有指紋峰，且共有指紋峰的面積占總峰面積的90%以上，以鹽酸小檗堿的色譜峰為參照峰（相對保留時間α和相對峰面積RA均為1），計算色譜圖中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3、4。

10個批次黃連藥材相對保留時間的RSD為0.19%～0.37%，表明樣品各共有峰之間的重合性好。相對保留峰面積RSD在5.79%～16.54%。每一個樣品所得到的非共有峰

總面積均小于10%，符合指紋圖譜研究要求的非共有峰占總峰面積百分比< 10%的規(guī)定。

2.4.2 相似度的計算。 將10批藥材出峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥指紋圖譜計算機(jī)輔助相似度計算軟件”輔助自動進(jìn)行峰匹配，

確定12共有峰，10批次黃連藥材的相似度在0.940～0.986（表5），表明所建立指紋圖譜的技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論與討論

（1）該研究對象為產(chǎn)于湖北利川黃連的干燥根皮，考察了不同提取劑、不同提取方法和時間的提取效果，結(jié)果以甲醇∶鹽酸（100∶1，V/V），超聲波提取40 min為最佳。該方法操作簡單、穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，為研究黃連的化學(xué)成分變化、全面評價黃連藥材的質(zhì)量提供了一種有效的方法。

（2）該研究對黃連指紋圖譜色譜條件進(jìn)行了考察，在流動相的選擇中，分別以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、乙腈-0.05 mol/L磷酸、乙腈-1%甲酸、甲醇-1%甲酸等不同體積分?jǐn)?shù)流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫試驗。結(jié)果表明，乙腈-0.05 mol/L磷酸進(jìn)行梯度洗脫最佳，能把大部分峰有效地分開，有利于指紋圖譜的分析。

（3）通過色譜圖，確認(rèn)10個黃連藥材有12個共有峰 ，以12號強(qiáng)峰作為參照峰，并計算相對保留時間和相對保留峰面積。共有峰的峰面積占總峰面積的92.31%～95.67%，符合指紋圖譜研究共有峰面積大于90%的規(guī)定。

（4）研究湖北利川黃連的指紋圖譜，按照該研究所提供的方法進(jìn)行色譜分析，將10批次藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入衛(wèi)生部藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004版）軟件對黃連指紋圖譜進(jìn)行相似度計算。結(jié)果表明，以10個批次黃連藥材相對峰面積的均值作為對照模板，相似度在0.940～0.986。該方法操作簡單，重現(xiàn)性強(qiáng)，專屬性好，能較好地體現(xiàn)黃連藥材成分的整體性。

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