木薯微莖尖離體培養(yǎng)

朱文麗　李開綿　陳松筆

摘 要 以木薯華南5號（SC5）和華南8號（SC8）微莖尖為外植體，通過比較試驗，對微莖尖的長度、初始培養(yǎng)基、繼代增殖和生根培養(yǎng)基進行篩選。結果表明：將長度為0.4～0.5 mm的木薯微莖尖外植體接種于初代培養(yǎng)基MS+6-BA 0.01 mg /L+NAA 0.02 mg /L+GA31.0 mg /L上培養(yǎng)30 d后，SC5和SC8成活率均達60.0%以上；初代培養(yǎng)的小苗在繼代和生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.02 mg /L上培養(yǎng)35 d后，SC5和SC8增值系數(shù)均達4.0以上，生根率達100%。建立了SC5和SC8木薯微莖尖離體培養(yǎng)技術體系，為下一步木薯脫毒培養(yǎng)奠定基礎。

關鍵詞 木薯；微莖尖；離體培養(yǎng)

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯屬植物，起源于熱帶美洲，廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，是非洲地區(qū)重要的糧食作物，也是中國重要的加工淀粉和生物質能源作物。近年來，為推動中國木薯產業(yè)發(fā)展，豐富木薯種質資源的遺傳多樣性，國內相關的研究機構及企業(yè)等不斷從國際熱帶農業(yè)中心（CIAT）和巴西國家農牧研究院（EMBRAPA）等國際組織和國外研究機構引進新的木薯種質。而新種質資源引進同時，也容易把一些病蟲害尤其是檢疫對象攜帶進國內，因此引進木薯種質的安全與健康極為重要。微莖尖培養(yǎng)已被廣泛用于馬鈴薯[1]、甘薯[2]、甘蔗[3]、芭蕉[4]和黃冠梨[5]等作物的快繁體系建立和健康種苗生產。在國內外，相關學者們對木薯組織培養(yǎng)及快速繁殖技術進行了較多的研究，采用的外植體主要有分生組織[6]、腋芽[7-11]、嫩葉[12-20]、莖尖[20]和花[21]等，以微莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)尚未見相關報道。本研究選用中國木薯主栽品種華南5號（SC5）和華南8號（SC8）的微莖尖為試驗材料，對其初代培養(yǎng)基、微莖尖長度、增殖和生根培養(yǎng)基進行篩選，旨在建立木薯微莖尖離體培養(yǎng)技術體系，為下一步脫毒苗的培育和種質資源的安全保存等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SC5和SC8試管苗由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所木薯組織培養(yǎng)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 木薯微莖尖初代培養(yǎng)基的篩選 在解剖鏡下剝取長度為0.4～0.5 mm、帶1～2個葉原基的莖尖，接種到3種激素培養(yǎng)基上（以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加3個不同質量濃度水平的NAA、6-BA、GA3，表1），考察不同激素種類和濃度組合對供試材料微莖尖初代培養(yǎng)成活率的影響。試驗采用L9（34）正交設計，參試的9個處理組合（簡稱處理）見表2，每個處理培養(yǎng)基添加20 g/L蔗糖，pH值為5.8，培養(yǎng)基以121 ℃滅菌，培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每個處理接種20個外植體，重復3 次，30 d后統(tǒng)計成活率（以莖段伸長1節(jié)以上和長出1～2片新葉為標準）和觀察生長情況，篩選出適合木薯微莖尖生長的初代培養(yǎng)基配方：

成活率/%=接種成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

1.2.2 莖尖長度對木薯微莖尖培養(yǎng)的影響 選取SC5和SC8生長健壯的試管苗，在解剖顯微鏡下剝離帶1～2個葉原基的莖尖，長度為0.2～0.3 mm和0.4～ 0.5 mm，接種到篩選出的最佳微莖尖初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每個處理接種20個外植體，重復3次，30 d后統(tǒng)計成活率和觀察生長情況，篩選出適合木薯微莖尖培養(yǎng)的莖尖長度。

1.2.3 繼代增殖與生根培養(yǎng) 在經初代培養(yǎng)獲得的小苗上切取長1.0～1.5 cm的頂芽或帶有側芽的莖段，接種于繼代培養(yǎng)基上進行增殖和生根培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光照強度2 000 lx，光周期12 h/12 h，每個處理接種20個外植體，重復3次，35 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)、生根率和觀察生長情況，篩選出適宜的微莖尖繼代培養(yǎng)基配方。繼代培養(yǎng)基為MS附加不同質量濃度的NAA、6-BA、GA3 3種激素，附加20 g/L蔗糖和6 g/L卡拉膠：

增殖系數(shù)=增殖的新頂芽和帶側芽莖段數(shù)/接種頂芽和帶側芽莖段數(shù)

生根率/%=生根的小苗數(shù)/接種小苗數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS9.2軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，其中，成活率經反正弦轉換后進行方差分析，多重比較采用Duncan測驗法。

2 結果與分析

2.1 木薯微莖尖初代培養(yǎng)的形態(tài)變化

將長度為0.4～0.5 mm的SC8微莖尖接種到初代培養(yǎng)基7 d后，莖尖頂端開始突起，顏色變綠（圖1-A）；14 d時莖尖長出長約4～7 mm的帶綠色小葉的芽（圖1-B）；30 d時莖尖伸長長成為2～4個節(jié)長的小苗，部分小苗長出1～2條根（圖1-C）。SC5微莖尖初代培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)育變化與SC8相似。

2.2 木薯微莖尖初代培養(yǎng)基的篩選

正交試驗參試的9個處理的成活率觀測及方差分析結果見表2。SC5和SC8微莖尖初代培養(yǎng)的9個處理的成活率差異分別達顯著（F=2.74*）和極顯著（F=7.94**）。SC5成活率最高的是處理5，達到68.3%，但節(jié)間細長，頂芽處斷開脫落。SC8成活率最高的是處理9，達70.0%，但莖尖有膨大現(xiàn)象，根部有愈傷組織產生，不利于養(yǎng)分的吸收。

對各處理的成活率進行正交試驗方差分析及Duncan測驗，結果見表3。由3個因子的F值大小可知，對SC5和SC8微莖尖初代培養(yǎng)成活率影響的大小依次均為：GA3>NAA>6-BA，即GA3的影響最大，水平間成活率達極顯著；NAA和6-BA的影響不大，均未達顯著水平。GA3 1.00 mg/L和3.00 mg/L水平的成活率均極顯著高于0.1 mg/L的成活率，而兩者間成活率差異不顯著。

可見，不同濃度NAA和6-BA對SC5和SC8微莖尖初代培養(yǎng)成活率的影響不大，當NAA濃度達0.04 mg/L，傷口處易產生愈傷組織，不利于營養(yǎng)吸收，影響后續(xù)生長。GA3不同濃度間的成活率差異達到極顯著水平；隨著GA3的濃度從0.1 mg/L增加到1.0 mg/L，節(jié)間生長速率加快，成苗率顯著提高；當GA3濃度達最高即3.0 mg/L時，節(jié)間變得細長，且易從頂芽處斷開，導致頂芽脫落。

根據(jù)方差結果和出于經濟角度考慮，得出0.01 mg/L NAA、0.01 mg/L 6-BA和1.00 mg/L GA3是SC5和SC8微莖尖初代培養(yǎng)最優(yōu)的培養(yǎng)基配方，但這個處理不在L9（34）正交設計中。為此，將經方差分析設計得出的最優(yōu)處理和L9（34）處理4進行了驗證試驗，結果顯示成活率差異不顯著；結合生長情況，發(fā)現(xiàn)外植體的萌動L9（34）處理4較方差分析的最優(yōu)處理提前3～5 d，得出MS+0.02 mg/L NAA+0.01 mg/L 6-BA+1.0 mg/L GA3是試驗的最佳微莖尖初代培養(yǎng)基配方。

2.3 莖尖長度對莖尖培養(yǎng)成活率的影響

從表4可知，不同的莖尖長度對SC5和SC8的莖尖成苗率有顯著影響。當莖尖長度為0.2～0.3 mm時，SC5和SC8莖尖成苗率很低，分別為8.9%和11.0%；莖尖長度為0.4～0.5 mm，SC5和SC8莖尖成苗率增加到64.0%和66.8%。由此可見，莖尖越短，成活率越低；莖尖越長，成活率越高。

2.4 微莖尖繼代增殖和生根培養(yǎng)

將微莖尖初代培養(yǎng)獲得的小苗接種到繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35 d后小苗長出新根，其增殖和生根培養(yǎng)在同一培養(yǎng)基中進行。由于莖尖初代培養(yǎng)的小苗比較幼嫩，為方便操作和減少損傷，第1次繼代培養(yǎng)接種于培養(yǎng)皿中（圖2-A），第2次繼代培養(yǎng)接入試管或培養(yǎng)瓶中（圖2-B）。

不同濃度激素配比對SC5和SC8微莖尖繼代培養(yǎng)增值系數(shù)和生根率的影響差異均不顯著（表5）。各處理的小苗均長勢良好，長出2～4條不定根，生根率達100%。其中處理1植株健壯，SC5增殖系數(shù)為4.18，SC8增殖系數(shù)4.19；處理2小苗生長節(jié)間明顯加長；處理3小苗初期生長速率較快，但根基部易產生愈傷，不利于后期營養(yǎng)吸收。

綜合考慮生長情況和經濟問題，認為MS+0.02 mg/L NAA是最佳微莖尖繼代培養(yǎng)基配方。

3 討論與結論

以微莖尖外植體進行離體培養(yǎng)是獲得莖尖脫毒種苗的一個關鍵技術。在進行微莖尖外植體離體培養(yǎng)時，植物生長調節(jié)劑的種類與濃度配比是關鍵因子。細胞分裂素與生長素的比值影響芽和根的分化[22]。據(jù)甘專等[23]報道，細胞分裂素在毛葡萄微莖尖離體培養(yǎng)的增殖與生根過程中起主導作用。趙福永[24]在研究棉花莖尖離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，0.10 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA是棉花莖尖生長的最佳條件。本研究中，0.01 mg/L 6-BA和0.02 mg/L NAA 有利于SC5和SC8的莖尖培養(yǎng)。在植物莖尖培養(yǎng)中，許多研究者都通過添加GA3來促進莖尖的萌發(fā)和伸長，提高莖尖培養(yǎng)成苗率[25]，這與本研究結果一致。本研究中，1.0 mg/L GA3是 SC5和SC8微莖尖培養(yǎng)的適宜濃度，這與Kartha等[26]報道（GA3適宜濃度為0.03 mg/L）的結果不符，這可能與不同材料的遺傳特性有關。

微莖尖長度是影響成活率的重要因素，一般來說，莖尖越長，成苗率越高。何歡樂等[27]發(fā)現(xiàn)取草莓莖尖長度為0.3～0.5 mm，成活率較高；曹冬煦等[28]在進行“巨峰”葡萄莖尖培養(yǎng)時也選取0.5 mm的莖尖。本研究發(fā)現(xiàn)切取的木薯莖尖長度為0.2～0.3 mm 時，成活率很低且操作難度大；而選取0.4～0.5 mm長的莖尖時成活率大大提高。

本研究中，木薯微莖尖僅經初代培養(yǎng)即能一步獲得完整的植株，只需切取頂芽和帶側芽的莖段進行繼代培養(yǎng)即可進行快速擴繁，該方法簡單，縮短了培養(yǎng)周期，但初代培養(yǎng)的成活率僅在60.0%左右，有待提高。以微莖尖為外植體的離體培養(yǎng)已成為最常用、經濟有效的脫毒方法，建立木薯微莖尖離體培養(yǎng)體系可為木薯健康種苗培育和種質資源保存提供技術參考。

參考文獻

[1] 孫秀梅， 李方華. 馬鈴薯微莖尖培養(yǎng)脫毒快繁技術[J]. 現(xiàn)代農村科技， 2012（10）： 76-77.

[2] 何新民， 蔣 菁， 唐洲萍， 等. 甘薯莖尖培養(yǎng)與脫毒技術研究[J]. 廣西農業(yè)科學， 2009， 40（8）： 964-968.

[3] Baksha B， Alam R， Karim M Z， et al. In vitro Shoot tip culture of sugarcane（Saccharum officinarum）Variety lad 28[J]. Biotechnology， 2002， 1（2-4）： 67-72.

[4] Vuylsteke D R. Shoot-tip culture for the propagation，conservation and exchange of Musa germplasm[M]. Rome： IBPGR Headquarters c/o FAO， 1989： 14-29.

[5] 宗 娟， 朱立武， 賈 兵. 黃冠梨莖尖離體培養(yǎng)再生體系建立初探[J]. 廣東農業(yè)科學， 2010， 9（2）： 51-53.

[6] Kartha K K. Regeneration of cassava plants from apical meristems[J]. Plant Sci Lett， 1974， 2： 107-113.

[7] Konan N K， Sangwan R S， Sangwan-norreel B S. Efficient in vitro shoot-regeneration systems in cassava（Manihot esculenta Crantz）[J]. Plant Breed， 1994， 113（3）： 227-236.

[8] 莫 饒， 吳繁花， 葉劍秋， 等. 木薯離體培養(yǎng)的研究[J]. 華南熱帶農業(yè)大學學報， 2003， 9（1）： 1-5.

[9] 曾文丹， 陸柳英， 謝向譽， 等. 優(yōu)良木薯品種新選048離體快繁技術[J]. 南方農業(yè)學報， 2014， 45（6）： 950-954.

[10] 何承光. 木薯良種GR891組織培養(yǎng)與快速繁殖技術[J]. 南方農業(yè)學報， 2011， 42（5）： 471-474.

[11] 何海旺， 何龍飛， 莫 克， 等. 木薯新品種新選048離體微扦插快速繁殖技術[J]. 廣西農業(yè)科學， 2010， 41（4）： 307-309.

[12] Shahin E A， Shepard J F. Cassava mesophyⅡ protoplasts： isolation， proliferation， and shoot formation[J]. Plant Sca Lett， 1980， 17（4）： 459-465.

[13]馬國華， 許秋生， 羨蘊蘭. 從木薯嫩葉直接誘導初生體細胞胚胎發(fā)生和芽的形成[J]. 植物學報， 1998， 40（6）： 503-507.

[14]Raemakers C J J M，Bessembinder J J E，Staritsky G，et al. Induction， germination and shoot development of somatic embryos in cassava[J]. Plant Cell Tissue Organ Cult， 1993， 33（2）： 151-156.

[15] Mathews S H， Schopke C， Carcamo R， et al. Improvement of somatic embryogenesis and plant recovery in cassava[J]. Plant Cell Rep， 1993， 12（6）： 328-333.

[16] Li H Q， Guo J Y， Huang Y W， et al. Regeneration of cassava plants via shoot organogenesis[J]. Plant Cell Rep， 1998， 17（5）： 410-414.

[17] Stamp J A， Henshaw G G.Somatic embtyogenesis in cassava[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie， 1982， 105（2）： 183-187.

[18] Stamp J A， Henshaw G G. Somatic embryogenesis from clonal leaf tissues of cassava[J]. Ann Bot， 1987， 59（4）： 445-450.

[19] 覃 艷， 陳 宇. 木薯組織培養(yǎng)快速繁殖的研究[J]. 廣西農業(yè)科學， 2007， 38（1）： 35-37.

[20] 朱文麗， 莫 饒， 李開綿， 等. 激素對木薯體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的影響[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（4）： 621-625.

[21] Barbara W， Johanna P K. Somatic embryogenesis from floral tissue of cassava（Manihot esculenta Crantz）[J]. Euphytica， 2001， 120（1）： 1-6.

[22] Vasanthi V J， Shanmugam V， Ramiah M. Elimination of Indian cassava mosaic virus in cassava through meristem tip culture and specific detection by serological means[J]. Orissa Journal of Horticulture， 2001， 29（2）： 69-74.

[23]甘 專， 劉 偉， 馬孟增， 等. 毛葡萄莖尖的離體培養(yǎng)與植株再生[J]. 西南農業(yè)學報， 2013， 26（3）： 1 164-1 168.

[24] 趙福永. 棉花莖尖培養(yǎng)及高效植株再生體系的建立[J]. 長江大學學報（自然科版）， 2008， 5（4）： 74-78.

[25] 陳君幟， 李 青， 孫 釗. 中國櫻桃半野生種對櫻的莖尖培養(yǎng)[J]. 園藝學報， 2003， 30（3）： 317- 318.

[26] Kartha K K， Gamborg O L. Elimination of cassava mosaic disease by meristem culture[J]. Phytopathology， 1975， 65（7）： 826-828.

[27] 何歡樂， 陽 靜， 蔡 潤， 等. 草莓莖尖培養(yǎng)快繁體系研究[J]. 上海交通大學學報（農業(yè)科學版）， 2003， 21（1）： 61-65.

[28] 曹冬煦， 周海峰， 于生成， 等. “巨峰”葡萄熱處理莖尖培養(yǎng)技術研究[J]. 北方園藝， 2012（9） ： 116-118.