胡椒EST—SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用

伍寶朵　郝朝運(yùn)　范?！罱ǚ濉∴w華松

摘 要 通過(guò)分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共得到unigene 23 524條，其中618條unigene中檢測(cè)到643個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，SSR發(fā)生頻率為2.63%，平均分布距離為12.86 kb。在643個(gè)EST-SSR中，二、三核苷酸重復(fù)是主要重復(fù)類(lèi)型，分別占27.84%和69.36%，其中（AG/CT）n、（AAG/CTT）n出現(xiàn)頻率最高，（NNN/NNN）5類(lèi)型占EST-SSR位點(diǎn)的42.90%。利用PRIMER3.0設(shè)計(jì)358對(duì)引物，隨機(jī)合成45對(duì)引物，并選用其中11對(duì)擴(kuò)增較好的多態(tài)性引物，對(duì)43份胡椒種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行初步檢測(cè)，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。結(jié)果說(shuō)明，胡椒EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是可行的，并能夠有效的用于胡椒遺傳分析研究，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 胡椒；轉(zhuǎn)錄組；EST-SSR；遺傳多樣性分析

中圖分類(lèi)號(hào) S573.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

胡椒（Piper nigrum L.）素有“香料之王”的美譽(yù)，既是世界最重要的香辛料作物之一，又具有藥用價(jià)值和工業(yè)利用價(jià)值[1-2]。胡椒是異花授粉植物，容易雜交，又能無(wú)性繁殖，易形成過(guò)渡類(lèi)型并留存下來(lái)，形成了豐富的胡椒基因資源。胡椒屬植物分布于南亞、南美洲、中美洲等熱帶地區(qū)，含有1 000多個(gè)植物種類(lèi)[3]。胡椒近緣野生種兼具起源古老和分化快速的特點(diǎn)，種間形態(tài)變異小，給種類(lèi)準(zhǔn)確鑒定造成了困難[4]。胡椒地方品種（如卡納瓦利、巴蘭哥塔等）、選育品種和育種品系（如興熱1號(hào)、云選1號(hào)、班尼約爾、Nedumchola、Vadakkan、73-F-5等）等資源較為豐富，并且品種或品系的遺傳背景復(fù)雜。另外，由于各國(guó)研究機(jī)構(gòu)引種渠道不明，且許多胡椒種質(zhì)形態(tài)特征相似[5]，難免存在重復(fù)引種，在長(zhǎng)期生產(chǎn)管理中很容易出現(xiàn)同物異名、同名異物、品種名混淆和品種產(chǎn)權(quán)不清等問(wèn)題，給胡椒育種和品種推廣工作帶來(lái)不利影響。遺傳多樣性分析可以準(zhǔn)確有效地對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，為核心種質(zhì)構(gòu)建提供依據(jù)，并減少育種工作中親本選配的盲目性，提高育種效率。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)大大提高了研究人員對(duì)植物遺傳學(xué)的研究水平，常用的分子標(biāo)記有RAPD，AFLP，SSR和SRAP等[6-7]。近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于胡椒遺傳多樣性分析[8-11]，但這些研究采用的標(biāo)記多數(shù)穩(wěn)定性差，其顯性遺傳特點(diǎn)也限制了區(qū)分雜交種質(zhì)的能力。與其他標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記（Simple sequence repeat， SSR）具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性、多等位性和數(shù)量豐富等特點(diǎn)[12]。EST-SSR（expressed sequence tag SSR）是基于表達(dá)的基因序列設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記，可直接反映功能基因的多樣性。隨著公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息的不斷增長(zhǎng)，大量的EST序列可以直接使用[13]。安澤偉等[14]利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中橡膠樹(shù)膠乳EST序列設(shè)計(jì)148對(duì)引物，并選用15對(duì)引物對(duì)44份橡膠樹(shù)無(wú)性系進(jìn)行了遺傳多樣性分析?？聺萚15]用芝麻不同種子發(fā)育時(shí)期cDNA文庫(kù)中獲得的EST，設(shè)計(jì)34對(duì)與油脂代謝相關(guān)基因的EST-SSR引物，為選育高油芝麻品種奠定基礎(chǔ)。目前，胡椒中關(guān)于SSR標(biāo)記和EST-SSR標(biāo)記研究利用的相關(guān)報(bào)道較少。Joy等[16]利用開(kāi)發(fā)的4個(gè)SSR標(biāo)記將44份印度胡椒種質(zhì)分為4個(gè)類(lèi)群，并確定了部分種質(zhì)。本研究利用NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有胡椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，分析胡椒EST-SSR的發(fā)生頻率和特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記，旨在為胡椒遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等遺傳研究提供一種高效便利的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用43份胡椒種質(zhì)均種植于香料飲料研究所內(nèi)的農(nóng)業(yè)部萬(wàn)寧胡椒種質(zhì)資源圃，其中選育品種和育種品系等20份，中國(guó)國(guó)內(nèi)野生近緣種23份，共17個(gè)種。材料具體名稱(chēng)見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 EST的獲得與處理 從NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX119532）下載胡椒葉片轉(zhuǎn)錄組序列（SRX119532）；利用Trinity軟件對(duì)部分序列進(jìn)行EST拼接，獲得胡椒的unigene；利用MISA軟件對(duì)unigene進(jìn)行SSR分析，具體參數(shù)設(shè)置為二、三、四、五核苷酸基序的重復(fù)次數(shù)至少為5次。

1.2.2 EST-SSR引物設(shè)計(jì) 利用PRIMER3.0設(shè)計(jì)SSR引物[17]，選用具有串聯(lián)重復(fù)長(zhǎng)度須大于12 bp的unigene，設(shè)計(jì)引物時(shí)GC%為40%～60%，引物長(zhǎng)度為（20±5）bp，左右引物復(fù)性退火溫度相差不大于5 ℃，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物100～300 bp；引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配等情況的發(fā)生。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳 采用OMEGA生物技術(shù)公司的DNA試劑盒提取供試材料的基因組DNA。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參考Joy等[16]并略加修改，其中包括：50 ng DNA模板，1×buffer，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，10 μmmol/L左右引物各1 μL，1.0 U DNA polymerase。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物最佳復(fù)性溫度通過(guò)梯度PCR反應(yīng)確定。

PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠分離。采用伯樂(lè)A101441通用電泳儀和北京君意JY-JX7電泳槽進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液，取1.5 μL上樣，150 V恒壓電泳50 min，電泳結(jié)束后用銀染法染色[18]。拍照，記錄結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)電泳結(jié)果，在相同遷移位置上有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，建立0、1矩陣。用聚類(lèi)分析軟件NTSYS-pc按公式S=2Nab/（2Nab+Na+Nb）計(jì)算各種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)，其中Nab為2個(gè)種質(zhì)共有帶型，Na為a特有帶型，Nb為b特有帶型[19]。然后根據(jù)相似系數(shù)用UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制系統(tǒng)聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒EST-SSR分布頻率和特性

用Trinity軟件拼接得到23 524條unigene，總堿基數(shù)為8 268 048 bp，其中618條unigene中共檢測(cè)到643個(gè)SSR位點(diǎn)，發(fā)生頻率（含有SSR位點(diǎn)的EST/總EST數(shù)目）為2.63%，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)平均間隔為12.86 kb；含有多于1個(gè)SSR位點(diǎn)的EST為25條，發(fā)生頻率為0.11%。

通過(guò)SSR位點(diǎn)搜索表明，胡椒EST-SSR種類(lèi)較為豐富，二至五核苷酸重復(fù)都有出現(xiàn)，但各核苷酸重復(fù)基元類(lèi)型出現(xiàn)頻率不同（表2）。其中三核苷酸SSR出現(xiàn)頻率（1.90%）明顯高于其他類(lèi)型，占總SSR的69.36%。另外二核苷酸SSR出現(xiàn)頻率較高（0.76%），占全部SSR的27.84%，因此二、三核苷酸SSR是能夠利用設(shè)計(jì)SSR引物的主要位點(diǎn)。四、五核苷酸SSR所占比例較小，總計(jì)僅為2.80%。

在643個(gè)SSR中存在80種重復(fù)基元類(lèi)型。在二、三、四核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最高的分別是（AG/CT）n、（AAG/CTT）n和（AAAG/CTTT）n。其在各自重復(fù)基元類(lèi)型中所占比例分別為41.34%、24.66%和37.50%（表3），另外五核苷酸重復(fù)基元數(shù)目只有2個(gè)。對(duì)于重復(fù)次數(shù)而言，二核苷酸重復(fù)6次、7次、8次所占頻率分別為12.17%、7.02%和4.21%；三核苷酸重復(fù)5次、6次、7次所占頻率分別為42.90%、18.56%和7.49%（圖1）。此外，EST-SSR位點(diǎn)的總長(zhǎng)度變化在12～25 bp之間，其中長(zhǎng)15 bp的最多，占42.90%，全為三核苷酸5次重復(fù)貢獻(xiàn)。

2.2 EST-SSR功能推測(cè)

將檢測(cè)到SSR位點(diǎn)的618條EST用Blastx在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中與其他序列進(jìn)行同源性比對(duì)，共199條（32.20%）與其他植物的序列具有同源性，與葡萄同源的序列有83條（41.70%），與毛果楊同源的序列有30條（15.07%），但多為未知功能基因，能夠得到基因注釋的基因多與擬南芥、水稻、蓖麻和馬鈴薯等同源。胡椒EST與葡萄、毛果楊同源的序列較多可能與3種植物均為多年生有關(guān)。

2.3 EST-SSR引物的多態(tài)性

根據(jù)含有SSR位點(diǎn)的618條EST序列，利用PRIMER3.0設(shè)計(jì)358對(duì)引物，隨機(jī)合成35對(duì)引物，其中20對(duì)引物沒(méi)有或具有模糊擴(kuò)增條帶，15對(duì)引物具有較好擴(kuò)增，占合成引物的比例為42.85%。選用具有較好擴(kuò)增的15對(duì)引物對(duì)43份胡椒種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，4對(duì)引物在43份材料間沒(méi)有多態(tài)性表現(xiàn)，其他11對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的多態(tài)性。11對(duì)引物共擴(kuò)增出110條帶，全部為多態(tài)性條帶。各引物具體特征見(jiàn)表4。

2.4 遺傳多樣性初步分析

利用11對(duì)引物對(duì)43份胡椒種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性初步分析。從UPGMA法聚類(lèi)圖中（圖3）可知，通過(guò)11對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增計(jì)算得到43份胡椒種質(zhì)的Nei's遺傳相似系數(shù)在0.464～1.000之間，平均值為0.754。其中復(fù)毛胡椒（FMHJ）和華山蒟（HSJ）間的相似系數(shù)最?。?.464），育種品系PC013、PC023和PC033間相似系數(shù)最高（1.000）。結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.637水平上，將43份資源分為兩類(lèi)，華山蒟（HSJ）、光莖胡椒（GJHJ）、頂花胡椒（DHHJ）、小葉爬崖香（XYPYX）等聚為一類(lèi)，栽培品種與其他野生種聚為一類(lèi)。來(lái)源于不同地區(qū)的同種野生種質(zhì)都聚在一起（如QSHJ1和QSHJ2等）。在相似系數(shù)為0.797水平上，栽培種聚為一個(gè)類(lèi)群。通過(guò)對(duì)43份胡椒種質(zhì)聚類(lèi)結(jié)果表明，本研究中開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記用于胡椒遺傳多樣性分析是有效、可行的。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，cDNA文庫(kù)、轉(zhuǎn)錄組序列等高通量測(cè)序大規(guī)模發(fā)展，EST-SSR在眾多植物種類(lèi)中得到了開(kāi)發(fā)和利用。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中能夠檢索到的胡椒EST序列有限，不能滿足設(shè)計(jì)EST-SSR標(biāo)記的需要，但有2個(gè)關(guān)于胡椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，通過(guò)生物信息學(xué)手段可以獲得大量EST序列進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)[20]。本研究充分利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)胡椒轉(zhuǎn)錄組信息，設(shè)計(jì)出358對(duì)EST-SSR引物，在合成的35對(duì)引物中11對(duì)引物具有有效擴(kuò)增，且有多態(tài)性擴(kuò)增，說(shuō)明開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記用于胡椒的遺傳研究是可行的。EST-SSR標(biāo)記具有較好的種屬通用性[21-24]，胡椒EST-SSR的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，有助于更好的對(duì)胡椒種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，同時(shí)為胡椒遺傳圖譜構(gòu)建提供更為穩(wěn)定的標(biāo)記。

本研究結(jié)果表明，在胡椒EST中SSR位點(diǎn)的平均分布距離為12.86 kb，分布頻率略高于棉花（14.8 kb）[25]。據(jù)大多數(shù)研究報(bào)道，植物EST-SSR主要集中在二、三核苷酸重復(fù)類(lèi)型，但主要重復(fù)基序類(lèi)型有差異。本研究中三核苷酸出現(xiàn)頻率最高，為69.36%，此結(jié)果與Joy等[26]的研究結(jié)果一致，并與小麥[21]、葡萄[27]、咖啡[28]、柑橘[29]、棉花[25]中三核苷酸比二核苷酸更為豐富的結(jié)論相符。三核苷酸基序中則以AAG/CTT重復(fù)為主，與柑橘[29]、棉花[25]、橡膠[14]等雙子葉植物類(lèi)似，但與Joy等[26]的研究結(jié)果不一致。造成這種差異的原因可能與開(kāi)發(fā)SSR引物時(shí)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)不同有關(guān)，還有可能是本研究分析數(shù)據(jù)的覆蓋度不足的局限造成的。

本研究所得618條EST中能夠比對(duì)出同源性的序列僅占其32.20%，并且多數(shù)為未知功能基因。這可能是因?yàn)榛勘蛔又参锬咎m類(lèi)基因組序列信息很少，在數(shù)據(jù)庫(kù)中已進(jìn)行基因組測(cè)序的都是單子葉或雙子葉植物，他們都與胡椒的系統(tǒng)發(fā)生較遠(yuǎn)[30-31]。本研究中雖然引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)格，但是如果引物序列落在兩個(gè)外顯子上，或兩引物間有一長(zhǎng)的內(nèi)含子，導(dǎo)致擴(kuò)增不出產(chǎn)物，可能是造成35對(duì)引物中20對(duì)引物沒(méi)有或具有模糊擴(kuò)增條帶的原因。

范睿等[32]利用ISSR標(biāo)記對(duì)部分中國(guó)胡椒屬種質(zhì)進(jìn)行了分析，Jiang等[33]同樣利用ISSR標(biāo)記分析了海南胡椒種質(zhì)。本研究采用的種質(zhì)全部為栽培種和中國(guó)野生種，屬于亞洲熱帶進(jìn)化支[34]，并對(duì)來(lái)源不同地區(qū)的同種胡椒種質(zhì)進(jìn)行了鑒定，同時(shí)利用了較為穩(wěn)定的EST-SSR標(biāo)記，為性狀關(guān)聯(lián)分析提供了可靠的標(biāo)記。研究結(jié)果中，在相似系數(shù)為0.797水平上，栽培種獨(dú)立成組聚為一類(lèi)；除源于不同地區(qū)的同種野生種質(zhì)聚在一起外，野生種質(zhì)聚類(lèi)結(jié)果物種相似性沒(méi)有表現(xiàn)出地域性特征，該結(jié)果與范睿等[32]研究結(jié)果相似，后續(xù)將增多分子標(biāo)記分析研究亞洲熱帶進(jìn)化支內(nèi)的胡椒地域性特征。雜交種（ZJZ）與PC009和黃花胡椒（HHHJ）的相識(shí)系數(shù)最大，分別為0.887和0.884，其表型與黃花胡椒相似，因此推測(cè)未知雜交種親本之一是黃花胡椒或與其親緣關(guān)系較近。在檢測(cè)的11對(duì)EST-SSR標(biāo)記中，PC013、PC023和PC033三個(gè)育種品系基因型沒(méi)有差異，表明3份種質(zhì)遺傳相似性極高，需更多的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

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