正交試驗(yàn)優(yōu)選柴胡中黃酮類化合物提取工藝的研究

唐志國(guó)等

摘要[目的] 優(yōu)選柴胡中黃酮提取的最佳工藝。[方法] 采用正交試驗(yàn)法對(duì)柴胡中黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以4個(gè)黃酮類活性成分（蘆丁、槲皮素、山奈素和異鼠李素）的總含量為指標(biāo)，采用液相方法測(cè)定。[結(jié)果] 最佳工藝為在50 ℃的60%乙醇（料液比1∶5）中浸漬30 min，超聲功率80 W提取20 min。[結(jié)論] 該工藝合理，有效成分提取效率高。

關(guān)鍵詞正交試驗(yàn)；柴胡；黃酮類化合物；HPLC；提取工藝

中圖分類號(hào)S567.7+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）24-055-02

中藥柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.和狹葉柴胡B.scorzonerifolium Willd.的干燥根，前者習(xí)稱北柴胡，后者習(xí)稱南柴胡。柴胡能散風(fēng)退熱、升陽(yáng)疏肝，用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、痢疾、肝郁氣滯、胸脅脹痛、子宮脫垂、脫肛、月經(jīng)不調(diào)等癥。北柴胡主產(chǎn)于河北、河南、遼寧、陜西等。柴胡為常用大宗藥材，其重要的藥用價(jià)值使需求逐年增加，不僅國(guó)內(nèi)需要量大，且大量出口。由于長(zhǎng)期依賴采挖，野生資源及其生境破壞嚴(yán)重，資源已近枯竭，目前商品柴胡主要依賴栽培。柴胡存在嚴(yán)重的種內(nèi)和種間類型混雜的現(xiàn)象，導(dǎo)致柴胡品種優(yōu)劣不等的問(wèn)題。不同地區(qū)使用的藥用部位也不盡相同，藥典規(guī)定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場(chǎng)上的藥材往往是根和5～10 cm莖的混品入藥，有人則以地上部分入藥。

柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油和多糖等，此外，還含有黃酮類成分。黃酮類化合物對(duì)人體在抗腫瘤、抗衰老及心血管等疾病的治療和預(yù)防有重要意義。如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變和降低毛細(xì)血管異常通透性及脆性的作用，臨床上用于治療過(guò)敏性紫癜及各種因毛細(xì)血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等。槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性及藥理作用，對(duì)呼吸道疾病，特別是對(duì)哮喘病和支氣管疾病有較好的作用。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于柴胡提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但多以皂苷類、揮發(fā)油指標(biāo)進(jìn)行考察，很少有單獨(dú)考察黃酮類化合物的文獻(xiàn)，因此，該研究采用正交試驗(yàn)考察柴胡中黃酮類化合物的提取及其不同部位的含量，為提高仿生栽培柴胡的質(zhì)量和療效打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器Waters2695高效液相色譜儀（2996紫外檢測(cè)器）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；METTLER AE240電子天平 RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥仿生栽培樣品采自黑龍江省的明水縣柴胡種植基地，野生柴胡樣品采自黑龍江省的明水縣本地；蘆?。ㄅ?hào)100080-200801）、槲皮素（批號(hào)100081-200502）、山柰素（批號(hào) 110861-200805）、異鼠李素（批號(hào)110860-200504）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3方法

1.3.1柴胡中黃酮類化合物含量測(cè)定。

1.3.1.1色譜條件。迪馬C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫，0～15 min（5%～20%A）、15～30 min（20%～35%A）、30～45 min（35%～45%A）、45～55 min（45%～50%A）、55～60 min（50%～5%A）；洗脫時(shí)間為60 min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流量1.0 ml/min；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

1.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。準(zhǔn)確稱取蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品各約20 mg，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度?；靹蚝蠓謩e進(jìn)樣2、5、10、20、30 μl，按“1.3.1.1”色譜條件作HPLC分析。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理，得蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的線性回歸方程和線性范圍（表1）。

1.3.2樣品測(cè)定。

精密吸取20 μl樣品溶液，在“1.3.1.1”色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算相應(yīng)黃酮類化合物的含量，再計(jì)算總量。

1.3.3正交試驗(yàn)。以柴胡中4種黃酮類化合物含量的總量

為指標(biāo)，設(shè)定pH=7、浸漬時(shí)間30 min、提取時(shí)間20 min，分別以乙醇溶度、料液比、浸漬溫度和超聲功率等主要因素及不同水平進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)（表2），篩選最佳工藝。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，浸漬溫度的極差Rj最大，其次是超聲功率，故對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響大小順序是A>D>B>C，即浸漬溫度>超聲功率>乙醇濃度>料

液比。由于料液比影響不顯著，故綜合考慮，選擇最佳方案

2.2最佳方案的驗(yàn)證試驗(yàn)

取柴胡的根、莖和葉分別按最佳方案提取，重復(fù)2次。結(jié)果（表4）顯示，此最佳工藝提取黃酮類化合物其含量較高，且工藝條件穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好。

3討論

（1）黃酮類化合物穩(wěn)定性差，在較高溫度下易分解氧化，因此提取時(shí)注意溫度的控制。

（2）分析葉片和莖中黃酮類化合物的含量高于傳統(tǒng)使用的根，劉秀芳等研究認(rèn)為小葉黑柴胡莖葉中總黃酮具有很好的抗氧化活性；詹雪晶等研究認(rèn)為柴胡莖葉中總黃酮對(duì)四氯化碳（CCl4）所致小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用。故很有必要對(duì)莖、葉進(jìn)行進(jìn)一步的研究，擴(kuò)大柴胡用藥部位。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄭漢臣，蔡少青.藥用植物學(xué)與生藥學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[3] ZHANG T T，ZHOU J，WANG Q.HPLC analysis of flavonoids fromthe aerial parts of Bupleurum species [J].Chin J Nat Medi，2010，8（2）：107-113.

[4] ELISA T，MAURIZIO L G，SANTO G，et al.Cirus flavonoids molecularstructure，biological activity and nutritional properties：A review [J].Food Chemistry，2007，104（2）：466-479.

[5] CRISTINA I M，ALESSANDRA B，SARA V，et al.Flavonoid characterizationand in vitro antioxidant activity of Aconitum anthora L.（Ranunculaceae）[J].Phytochemistry，2008，69（5）：1220-1226.

[6] 岳志勁，關(guān)翠林，王海青，等.RPHPLC 法測(cè)定柴胡中四種黃酮類成分的含量[J].山西大同大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，26（4）：35-38.

[7] 王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（2）：171-173.

[8] 劉秀芳，李婷婷，蔡光明，等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮體外抗氧化活性的研究[J].中南藥學(xué)，2011，9（3）：172-175.

[9] 詹雪晶，蔡霈，蔡光明，等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中南藥學(xué)，2011，9（4）：241-243.