雪菊對肝癌和肺癌細(xì)胞體外抗腫瘤作用研究

帕爾哈提?買買提依明等

摘要

[目的]研究雪菊不同提取物對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。[方法]體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞（7404）及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549），用不同濃度的雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖分別對細(xì)胞作用后，MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞的凋亡率。[結(jié)果]通過MTT的方法得出雪菊不同提取物對7404和A549均有抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度和時間的依賴性。流式細(xì)胞儀檢測總黃酮純化物能增強7404和A549細(xì)胞的凋亡率。[結(jié)論]雪菊不同提取物對2種癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，其作用機制可能與增強細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞雪菊；人肝癌細(xì)胞；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；生長抑制；細(xì)胞凋亡；抗腫瘤

中圖分類號S567文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）24-046-03

雪菊又名“血菊”，為菊科金雞菊屬（Coreopsis）植物，是目前新疆與雪蓮齊名的野生植物。雪菊具有降血壓、降血脂、抗衰老、抗癌、抗炎等生物活性。國內(nèi)關(guān)于雪菊的體外抗腫瘤并未報道，國外的報道僅限于雪菊的單體對小鼠皮膚腫瘤抑制作用。癌癥儼然成為危害了人類健康的頭號殺手。由于主流的治療癌癥的方法存在諸多缺陷，世界科學(xué)家開始把抗腫瘤藥物研究的目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物上，一些具有抗腫瘤作用的天然活性成分陸續(xù)從中草藥中被分離發(fā)現(xiàn)。筆者在此體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞（7404）及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549），用不同濃度的雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖分別對細(xì)胞作用后，MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞的凋亡率，探討雪菊總黃酮和總多糖對人肝癌細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖的抑制作用，為雪菊的藥理活性深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Benchmark PLUS型全波長酶標(biāo)儀（美國BIORAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國BECKMAN公司）；倒置熒光三目顯微鏡（美國CoolSNAP）；ZHJH-1214C型超凈工作臺（中國上海智城有限公司）；TP114型電子天平（美國丹佛公司）；Br4i型低溫離心機（美國Jouan公司）。

1.1.2

試劑。胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號141012）；二甲基亞砜（美國MP Biomedicals公司，批號M5178）； 培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號AZG190856）；噻唑藍(lán)MTT（美國sigma公司，批號M5655）；凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號3337788）；胰酶（美國Gibco公司，批號25200）。

1.1.3

腫瘤細(xì)胞。人肝癌細(xì)胞（7404）和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）由新疆第一附屬醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所阿爾孜古麗·吐爾遜老師惠贈。

1.1.4

藥材。昆侖雪菊為菊科金雞菊屬（Coreopsis）植物，于2013年6～9月在新疆和田地區(qū)昆侖山采集，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為菊科金雞菊品種。

1.1.4.1

昆侖雪菊總黃酮提取物。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀萃取30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總黃酮含量為22.56%。

1.1.4.2

總黃酮純化物。由雪菊總黃酮粗提物經(jīng)聚酰胺純化工藝獲得，總黃酮含量為68.04%。

1.1.4.3

昆侖雪菊總多糖。雪菊于60 ℃干燥1 h研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，1∶20投料比，加40 ml蒸餾水，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀，超聲30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總多糖含量為24.74%。

1.2 方法

1.2.1

供試液的制備。精密稱定雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亞砜（DMSO）溶解于10 ml容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的3種供試液，4

℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋分別配制成不同濃度

的3種供試液，并保證各供試液中DMSO的體積分?jǐn)?shù)<0.1%。

1.2.2

MTT法測細(xì)胞增殖抑制率。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，調(diào)整7404和A549細(xì)胞懸浮液密度為3×104個/ml，將配制好的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁情況，貼壁狀況良好后，將每孔的培養(yǎng)液輕輕取出，將雪菊總黃酮純化物、粗提物及總多糖3個試驗組分別加入最終濃度為50、100、200、400、600 μg/ml提取物的培養(yǎng)液200 μl，空白對照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，陽性對照組則為濃度為20 μg/ml的順鉑，每組4個孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48、72、96 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振蕩混勻后，用Benchmark PLUS型全波長酶標(biāo)儀檢測各孔在波長490 nm處的吸光度值，并按公式計算細(xì)胞生長抑制率，生長抑制率=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.3

檢測細(xì)胞凋亡。取7404和A549的對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁狀況，狀態(tài)良好時，分別加入100、200、400 μg/ml不同濃度的雪菊總黃酮純化物，并設(shè)立細(xì)胞對照組（不加藥物），再置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)，把各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液分別吸到15 ml離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化下來，加完全培養(yǎng)液終止后，收集并放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，取含有2×105個細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入100 μl緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC和PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，再加入400 μl的緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測雪菊不同提取物對細(xì)胞增殖的抑制作用

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人肝癌細(xì)胞7404，72 h后，觀察不同濃度的樣品對7404細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及雪菊總多糖對7404細(xì)胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為261.58、52.27、531.21 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各濃度組與對照組比較，有顯著性差異（P<0.01）。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比雪菊黃酮粗提取物及其總多糖對細(xì)胞的抑制作用強。

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，觀察不同濃度的樣品對A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖對A549細(xì)胞增殖均有抑制作用，其IC50分別為230.45、93.62、45429 μg/ml，且抑制率均隨樣品濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各濃度組與對照組比較有顯著性差異（P<0.01）。通過各提取物的IC50比較，得出雪菊總黃酮純化物比黃酮粗提取物及其總多糖對細(xì)胞的抑制作用強。

2.2 MTT法檢測相同濃度下雪菊不同提取物對細(xì)胞作用時間與抑制率的關(guān)系

從雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時不同提取物對人肝癌細(xì)胞（7404）和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）隨時間增長的關(guān)系圖（圖1）可以看出，樣品濃度固定時，隨著樣品作用時間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用增強，呈現(xiàn)時間依賴性。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測雪菊總黃酮純化物對細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法進行凋亡率的測定，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，100、200、400 μg/ml的雪菊總黃酮純化物作用7404、A549細(xì)胞72 h后，隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

3結(jié)論

惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。在惡性腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。合成的化學(xué)類抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)都是以天然抗腫瘤活性成分為先導(dǎo)化合物的。我國有豐富的天然藥用動物、植物和礦物資源，自20世紀(jì)60年代以來，我國的醫(yī)藥專家根據(jù)各民族運用天然抗腫瘤藥物的經(jīng)驗，從民族醫(yī)藥中研究和開發(fā)出了一批療效確切、價格合理的天然抗腫瘤藥物。黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗腫瘤活性等。因此該試驗所研究的雪菊總黃酮的抗腫瘤活性為雪菊藥理活性的研究奠定基礎(chǔ)。

MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，靈敏度高、簡便快速，最常用于體外抗腫瘤藥物篩選的方法。該試驗采用MTT法對雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖進行體外抗腫瘤活性進行初步研究，結(jié)果表明，雪菊總黃酮粗提物、總黃酮純化物及總多糖對人肝癌細(xì)胞（7404）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）有一定的抑制作用，其中雪菊總黃酮純化物對2種腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強，從而進行雪菊總黃酮純化物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試驗，流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法測定凋亡率表明，隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

綜上所述，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖能抑制7404、A549細(xì)胞的增殖，呈劑量與時間依賴性，總黃酮純化物抑制作用尤為明顯，其抑制細(xì)胞增殖的機制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。但雪菊總黃酮純化物作為一種天然提取物，其成分復(fù)雜，對于是否還存在其他途徑，有待進一步的探討。

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