MALDI質(zhì)譜分析PEG5000和BSA的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

劉雅琴， 鄒建凱， 裘雅漁

(浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310027)

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MALDI質(zhì)譜分析PEG5000和BSA的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

劉雅琴， 鄒建凱， 裘雅漁

(浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310027)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是質(zhì)譜分析中新型的大型儀器之一，通過(guò)開(kāi)設(shè)新型大型儀器MALDI-TOF質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)課程，有效地開(kāi)拓學(xué)生的專(zhuān)業(yè)視野。針對(duì)不同的樣品選擇不同的基質(zhì)和采取不同的檢測(cè)模式，本實(shí)驗(yàn)以不同分子量范圍的兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)為例，聚乙二醇5000選擇2,5-二羥基苯甲酸作為基質(zhì)；牛血清白蛋白選擇芥子酸為基質(zhì)，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。有效地讓學(xué)生了解MALDI儀器的性能和應(yīng)用范圍，為他們今后從事科學(xué)研究工作奠定良好的基礎(chǔ)，也讓大型儀器全面支撐研究生教學(xué)，進(jìn)一步提高了分析儀器的利用率。

MALDI質(zhì)譜； BSA蛋白； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)； 大型儀器

0 引 言

在化學(xué)分析中，質(zhì)譜與核磁共振、紅外光譜、紫外光譜被認(rèn)為是有機(jī)結(jié)構(gòu)分析的四大表征工具。有機(jī)質(zhì)譜具有特別重要的地位，是近代分析中的重要技術(shù)之一，20世紀(jì)80年代末誕生的基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)，使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生革命性的變革，擴(kuò)展到高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的大分子的分析研究[1-3]。近30年來(lái)，質(zhì)譜發(fā)展非常迅速，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)，在大分子領(lǐng)域的應(yīng)用為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了獨(dú)特的生物質(zhì)譜技術(shù)。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[4-11]。

為了開(kāi)拓學(xué)生的專(zhuān)業(yè)視野，我系將新型的有機(jī)質(zhì)譜MALDI-TOF MS儀器加入到研究生的儀器分析實(shí)驗(yàn)課程中。本實(shí)驗(yàn)首先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器的質(zhì)量校準(zhǔn)，然后在反射模式下對(duì)聚乙二醇5000 (PEG5000)樣品進(jìn)行檢測(cè)；在線(xiàn)性模式下對(duì)牛血清白蛋白樣品(BSA)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)MALDI質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)的微調(diào)，分別獲得高分辨的PEG5000質(zhì)譜圖和相對(duì)分子質(zhì)量為66KD的大分子BSA質(zhì)譜圖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在3 h以?xún)?nèi)，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性高，適合在研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)原理

儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)，如圖1所示。MALDI的原理有多種假說(shuō)，但公認(rèn)的一個(gè)機(jī)制是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即所測(cè)定的離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比。通常在MALDI源中產(chǎn)生的主要是完整的準(zhǔn)分子離子，這也是MALDI質(zhì)譜圖的最大特點(diǎn)之一。由于MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，其質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量常常有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系[12]。

2 儀器與試劑

Bruker公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，型號(hào)Ultraflex。聚乙二醇5000購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(化學(xué)純)，牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司， 2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和芥子酸(SA) 購(gòu)自美國(guó)布魯克?道爾頓公司(色譜純)。

圖1 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀的構(gòu)造和原理

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖2。

圖2 MALDI-TOF的實(shí)驗(yàn)流程

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 樣品的制備。根據(jù)樣品的性質(zhì)和相對(duì)分子質(zhì)量范圍，本實(shí)驗(yàn)選擇兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)，聚乙二醇5000選擇2,5-二羥基苯甲酸作為基質(zhì)；牛血清白蛋白選擇芥子酸為基質(zhì)。移動(dòng)1 μL樣品和1 μL基質(zhì)均勻混合，將1 μL混合溶液點(diǎn)在樣品靶上，自然干燥，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

(2) 質(zhì)量校準(zhǔn)。選擇相應(yīng)質(zhì)量數(shù)的校準(zhǔn)文件，采集譜圖，進(jìn)行校準(zhǔn)。若誤差值較大，應(yīng)反復(fù)校準(zhǔn)，直到滿(mǎn)足要求。如圖3所示，外標(biāo)物為Bradykinin(1～7) (757.399Da)，Angiotensin II (1 046.542 Da)，Angiotensin I (1 296.695Da)，Substance P (1 347.735Da)，Bombesin (1 619.822 Da)，ACTH_clip(1～17) (2 093.086 Da)，ACTH_clip (18～39) (2 465.198 Da) 和 Somatostatin 28 (3 147.471Da)。

圖3 外標(biāo)物的質(zhì)量校準(zhǔn)質(zhì)譜圖

(3) 相對(duì)分子量質(zhì)測(cè)定：采用不同模式MALDI-TOF MS 進(jìn)行分析,儀器參數(shù)設(shè)置如下：① 測(cè)定PEG5000時(shí)，激光波長(zhǎng)355 nm，加速電壓25.0 kV，反射電壓26.5 kV，脈沖離子提取時(shí)間130 ns， 聚焦電壓8.0 kV，反射檢測(cè)器電壓2.305 kV。② 測(cè)定BSA蛋白時(shí)，激光波長(zhǎng)355 nm，加速電壓25.0 kV，脈沖離子提取時(shí)間500 ns，聚焦電壓34.0 kV。線(xiàn)性檢測(cè)器電壓2.955 kV。在測(cè)量過(guò)程中可隨時(shí)調(diào)整激光能量和靶板位置以獲得最佳信噪比和分辨率。

(4) 測(cè)試結(jié)束，退靶，取出靶板，關(guān)閉軟件。普通靶板的清洗方法，順序依次為： 熱水擦洗； 甲醇或乙腈擦洗；丙酮或異丙醇浸沒(méi)靶板超聲20 min；100% Millipore純水擦洗；自然晾干，放入靶板盒。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

教學(xué)實(shí)驗(yàn)必須具有理論依據(jù)明確、操作步驟簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性高等特點(diǎn)[13]。為了達(dá)到上述要求，對(duì)基質(zhì)的選擇、聚乙二醇5000的質(zhì)譜分析和牛血清白蛋白的質(zhì)譜分析三個(gè)方面做了深入細(xì)致地探討。

4.1 基質(zhì)的選擇

基質(zhì)的使用是MALDI電離技術(shù)的關(guān)鍵，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量并氣化，同時(shí)將樣品分子帶入氣相，樣品分子只吸收少量的激光能量，避免了被分析物分子化學(xué)鍵的斷裂。此外，基質(zhì)在樣品離子形成過(guò)程中還充當(dāng)質(zhì)子化或去質(zhì)子化試劑，使樣品分子帶上正電荷或負(fù)電荷。目前，常用于分析蛋白質(zhì)和多肽的基質(zhì)是一些能夠很好的吸收和傳遞激光能量小分子的有機(jī)酸及其衍生物，實(shí)際使用時(shí)也需要根據(jù)被分析物的要求作相應(yīng)選擇。一般說(shuō)來(lái)，基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)適用于多肽類(lèi)或相對(duì)分子質(zhì)量小于10KD的樣品，芥子酸適用于相對(duì)分子質(zhì)量較大(>10KD)的蛋白質(zhì)樣品和極性聚合物，而2,5-二羥基苯甲酸則適用于有機(jī)合成分子或極性聚合物等樣品，如表1所示。

表1 常用基質(zhì)的基本信息

4.2 聚乙二醇5000的質(zhì)譜分析

樣品聚乙二醇5000的質(zhì)譜圖，如圖4所示，最強(qiáng)峰m/z是5166.152，這與樣品本身的相對(duì)分子質(zhì)量范圍相吻合。其中，質(zhì)譜峰m/z 5 166.152與5 254.305之間的質(zhì)量差值為88，可推斷是相差2個(gè)CH2CH2O結(jié)構(gòu)單元的分子離子峰，這一結(jié)果與樣品本身的是聚乙二醇的特征相一致。反射模式下，樣品分子離子在加速電壓的作用下，飛行至管道末端再受到反射電壓的作用進(jìn)入反射場(chǎng)區(qū)。在進(jìn)入反射場(chǎng)區(qū)前，即在飛行管道末端的延遲電場(chǎng)補(bǔ)償了分子離子的初始空間和能量分布[14]，待離子達(dá)到零動(dòng)能狀態(tài)后，再次受到反方向電壓的作用運(yùn)動(dòng)至反射檢測(cè)器，其飛行距離比線(xiàn)性模式長(zhǎng)。因此反射模式提高了質(zhì)譜分辨率，特別是分子量在4 000 Da以下的分子[15]。

圖4 樣品聚乙二醇5000的質(zhì)譜圖

4.3 牛血清白蛋白的質(zhì)譜分析

樣品牛血清白蛋白的質(zhì)譜圖，如圖5所示，最強(qiáng)峰 m/z 66 161.347對(duì)應(yīng)為牛血清白蛋白的單聚體單電荷分子離子峰，這與文獻(xiàn)報(bào)道的牛血清白蛋白的單聚體分子量為66～68KD相吻合。質(zhì)譜峰 m/z 132 573.981對(duì)應(yīng)為牛血清白蛋白的二聚體單電荷峰，質(zhì)譜峰 m/z 33048.976對(duì)應(yīng)為牛血清白蛋白的單聚體雙電荷峰，剩下的可能是雜質(zhì)峰。在線(xiàn)性模式下，離子未經(jīng)過(guò)反射作用及較短的飛行距離可能更好地保留大分子的高聚物，但其形成的分子離子峰較寬，分辨率較低，無(wú)法分辨同位素峰。

圖5 牛血清白蛋白的質(zhì)譜圖

5 結(jié) 語(yǔ)

為開(kāi)拓學(xué)生的專(zhuān)業(yè)視野，我系將新型大型儀器有機(jī)質(zhì)譜儀MALDI-TOF MS加入到研究生的儀器分析實(shí)驗(yàn)課程中。根據(jù)樣品的性質(zhì)和分子量范圍，本實(shí)驗(yàn)選擇兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生可以自主使用MALDI-TOF質(zhì)譜大型儀器對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試分析，需要針對(duì)樣品的性質(zhì)選擇不同的基質(zhì)，根據(jù)樣品所處質(zhì)量范圍利用不同檢測(cè)模式，了解反射模式具有分辨率高而線(xiàn)性模式具有靈敏度高的特點(diǎn)。使他們有效地掌握了相關(guān)測(cè)試手段，也讓大型儀器全面支撐研究生教學(xué)，進(jìn)一步提高了分析儀器的利用率。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)提出基于科研工作，實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，涉及有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、物理知識(shí)等多方面內(nèi)容，將科研與教學(xué)有機(jī)結(jié)合，能夠使學(xué)生充分了解科學(xué)研究的基本步驟及過(guò)程，開(kāi)拓專(zhuān)業(yè)視野及培養(yǎng)創(chuàng)新思維具有重要意義[16]。能夠有效提高學(xué)生的科研興趣，為他們今后從事科學(xué)研究工作奠定良好的基礎(chǔ)，培養(yǎng)更多技術(shù)型人才。

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Experiments Teaching on MALDI-TOF MS Analysis of PEG5000 and BSA

LIUYa-qin,ZOUJian-kai,QIUYa-yu

(Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou, 310027, China)

Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one of the new type of precision instruments in mass spectrometric analysis. Through teaching experiment of MALDI-TOF mass spectrometry, the professional vision of students is widened effectively. According to the property of samples, different matrices and detection models are selected. In this paper, the samples of polyethylene glycol 5000 and bovine serum albumin (66KD) were taken as typical examples, the 2, 5-dihydroxybenzoic acid is selected as a matrix of polyethylene glycol 5000, while sinapinic acid as the matrix of bovine serum albumin for mass spectrometric detection. It made students understand the properties and application of the MALDI instrument, and made a good foundation for their future engaged in scientific research. Furthermore, the precision instruments supporting graduate teaching were revealed, by which the utilization rate of analysis instrument was also improved.

MALDI mass spectrometry； bovine serum albumin; experiment teaching; large-scale precision instruments

2014-11-03

浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37007)；浙江大學(xué)資助項(xiàng)目(SYB201402)

劉雅琴(1981-)，女，湖北十堰人，博士，助理研究員，主要從事MALDI質(zhì)譜和核磁共振研究。

Tel.：13777850547，0571-87951264；E-mail：yaqin86@zju.edu.cn

O 657.63；G 642.0

A

1006-7167(2015)10-0183-04