PRRSV HEB-2013株的分離與全基因序列分析

張東東，劉燦，龔文芝，寧宜寶?，范學(xué)政，張金亞

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

PRRSV HEB-2013株的分離與全基因序列分析

張東東1，劉燦2，龔文芝1，寧宜寶1?，范學(xué)政1，張金亞1

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

2013年9月從河北某發(fā)病豬場(chǎng)分離到1株豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），將該毒株命名為HEB-2013株，在進(jìn)行全基因組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，HEB-2013株基因組全長(zhǎng)為15336 nt，包含9個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中5’UTR長(zhǎng)189 nt，3’URT長(zhǎng)165 nt；隨后將該毒株的全基因序列與NCBI上可查的歷年華北地區(qū)PRRSV基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與2006年分離的TJ株同源性最高，為99.80%，而與2000年分離的BJ-4株同源性最低，僅為88.39%，進(jìn)一步綜合NSP2、GP3和GP5的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，系統(tǒng)分析了潛在毒力位點(diǎn)與病毒致病性的關(guān)系，并且提出了5個(gè)新的有可能與病毒致病性相關(guān)的潛在毒力位點(diǎn)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離；全基因序列分析；分子特征

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病［1］。其特征為厭食、發(fā)熱，懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎；幼齡仔豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病和大量死亡［2］，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV歸屬于動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），PRRSV基因組全長(zhǎng)約為15 kb，含有至少9個(gè)開(kāi)放閱讀框架（ORFs），其中PRRSV的ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2-ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白［3］。根據(jù)PRRSV基因的變異程度將其分為兩個(gè)地理群或者基因型，即以歐洲原型病毒LV株為代表的歐洲基因型（簡(jiǎn)稱Ⅰ型）和以美國(guó)原型病毒ATCC VR-2332為代表的美國(guó)基因型（簡(jiǎn)稱Ⅱ型），兩型病毒均具有典型的免疫抑制特性［4］。歐洲和北美分離的毒株在形態(tài)和理化性狀上相似，但是用多克隆豬抗體和小鼠單克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)證實(shí)在抗原性上有差異［5］。PRRSV給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失，在1996年與2006年的兩次暴發(fā)尤其嚴(yán)重［6］，之后疫情雖已獲得穩(wěn)定控制，但田間的流行情況仍然不容忽視。2013年河北某豬場(chǎng)出現(xiàn)不同懷孕時(shí)期的母豬大量流產(chǎn)，產(chǎn)死胎與弱胎，弱胎表現(xiàn)體溫升高、呼吸困難以及大面積皮膚紅斑，實(shí)驗(yàn)室診斷確診為豬繁殖與呼吸綜合征，并分離獲得一株P(guān)RRSV，命名為HEB-2013株，該毒株基因組的NSP2蛋白基因中存在30個(gè)氨基酸缺失，而該基因標(biāo)志廣泛存在于2006年及之后中國(guó)大陸流行的高致病性PRRSV［7］。

NSP2氨基酸序列在北美洲株（VR2332）和歐洲株（LV）之間的同源性僅為32%，而且NSP2基因中含有B細(xì)胞表位免疫的優(yōu)勢(shì)基因；GP3是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，在歐、美型毒株間推導(dǎo)氨基酸的同源率為54%～60%，而且多數(shù)變異發(fā)生在N末端；GP5為糖基化的囊膜（E）蛋白，含4個(gè)糖基化位點(diǎn)和一段31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。PRRSV不同毒株的毒力有較大差異，但毒力基因尚不十分清楚，Allende等報(bào)道PRRSV不同ORFs上有9個(gè)毒力相關(guān)的氨基酸殘基［8］。

為了進(jìn)一步揭示我國(guó)華北地區(qū)流行的PRRSV的基因特征和變異規(guī)律，本研究對(duì)該分離株進(jìn)行了鑒定與基因組測(cè)序，并與華北地區(qū)2000年至今的27株P(guān)RRSV的基因組進(jìn)行了比對(duì)分析，以期查明華北地區(qū)流行PRRSV的遺傳變異特征，為防控PRRS提供有益的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒 Marc-145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，病毒HEB-2013株分離于發(fā)病豬的肺臟，該研究中序列比對(duì)所用的毒株信息見(jiàn)表1。

表1 使用的毒株信息

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Primescript RT Master Mix、Premix Taq HS、各種限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；研究中所用引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照已發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒GD株的基因序列，設(shè)計(jì)9對(duì)擴(kuò)增基因組內(nèi)部片段的引物（表2），應(yīng)用RACE技術(shù)對(duì)HEB-2013株的5’末端和3’末端UTR進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。

表2 引物及在GD株全基因序列位置

1.2.2 病毒核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄 取病毒培養(yǎng)液，按RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)的操作方法進(jìn)行病毒RNA的提??；然后把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3 目的基因分段擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為25 μL，Premix Taq HS 12.5 μL、dH2O 8.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA模板2 μL，PCR循環(huán)參數(shù)為98℃10 s、52～56℃30 s、72℃1 min 30 s；72℃延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.4 基因序列測(cè)定 取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)純化后連接到pMD18-T載體，經(jīng)驗(yàn)證有目的基因插入后，送英濰捷基公司測(cè)序。

1.2.5 序列比較與分析 通過(guò)對(duì)分段完成測(cè)序的基因序列進(jìn)行拼接獲得PRRSV HEB-2013毒株的全基因組序列。利用DNASTAR軟件將HEB-2013與華北地區(qū)2000-2010年的代表毒株進(jìn)行全序列比對(duì)分析以及NSP2、GP3與GP5氨基酸比對(duì)分析，并利用MEGA軟件對(duì)GenBank上收錄的近年來(lái)我國(guó)華北地區(qū)PRRSV（表1）全基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 全序列測(cè)定 將測(cè)序結(jié)果拼接后獲得HEB-2013株全基因序列，全長(zhǎng)15336 bp，包含9個(gè)ORFs，5’UTR長(zhǎng)189 nt，3’URT長(zhǎng)165 nt。

2.2 序列同源性比較分析 HEB-2013株所有非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列與GeneBank收錄的近年來(lái)華北地區(qū)PRRSV毒株BJ、BJ-4、HEB1、NM1、TJ、SX2007、SX-09、SX2009、09BJ、09HEB、10-10BJ-1、10-10HEB-1的同源性比較和分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 HEB-2013株與華北地區(qū)其他部分毒株基因組結(jié)構(gòu)基因與非結(jié)構(gòu)基因同源性比較

續(xù)表

2.3 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果 我國(guó)華北地區(qū)近年來(lái)流行的27株P(guān)RRSV的全序列基因組進(jìn)化樹(shù)，如圖1。

圖1 我國(guó)華北地區(qū)近年來(lái)流行的PRRSV毒株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 NSP2、GP3、GP5基因氨基酸序列的比對(duì)分析

對(duì)HEB-2013株與其他毒株的NSP2基因氨基酸進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)近年來(lái)華北地區(qū)分離的高致病性PRRSV變異毒株在482位和第534～562位氨基酸均發(fā)生了缺失。HEB-2013株和這些高致病性毒株相同，在482位和第534～562位氨基酸也發(fā)生了缺失（圖2）。GP5、GP3、基因氨基酸序列與近年來(lái)華北地區(qū)其他毒株比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖2 HEB-2013株與華北地區(qū)其他部分毒株Nsp2基因氨基酸序列的比較

圖3 HEB-2013株與華北地區(qū)其他部分毒株GP5基因氨基酸序列的比較

圖4 4 HEB-2013株與華北地區(qū)其他部分毒株GP3基因氨基酸序列的比較

2.5 毒力相關(guān)氨基酸的推測(cè)與變異分析 毒力相關(guān)氨基酸的推測(cè)結(jié)果顯示9，個(gè)潛在的毒力相關(guān)氨基酸位點(diǎn)處，該研究所分離的HEB-2013株與華北地區(qū)近年來(lái)流行的大部分毒株完全相同，可以發(fā)現(xiàn)它們已經(jīng)趨與穩(wěn)定遺傳，而這些毒株與經(jīng)典強(qiáng)毒株BJ-4株有較大差異，9個(gè)毒力相關(guān)氨基酸中只有3個(gè)與BJ-4保持一致，見(jiàn)表4。

表4 毒力相關(guān)氨基酸的推測(cè)與變異分析

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒的毒力基因尚不清楚，Byungjoon等報(bào)道，NSP3-NSP8以及ORF5是病毒毒力的主要決定區(qū)，NSP1-NSP3、NSP10-NSP12以及ORF2可能也與病毒毒力相關(guān)［11］。NSP2基因中30個(gè)氨基酸的缺失之前被猜測(cè)為該類變異的高致病性PRRSV毒力變強(qiáng)的原因，該研究分離的PRRSV HEB-2013株屬于美洲型毒株，經(jīng)過(guò)分析其全序列發(fā)現(xiàn)，在NSP2基因區(qū)段缺失30個(gè)氨基酸，這與近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的高致病性毒株相同。但是，Zhou等通過(guò)反向遺傳學(xué)的操作對(duì)推測(cè)的與毒力相關(guān)的基因進(jìn)行缺失或互換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性PRRSV變異毒株NSP2區(qū)段中缺失的30個(gè)氨基酸與毒株的毒力無(wú)關(guān)［12］。安同慶等曾對(duì)24株P(guān)RRSV病毒的全基因組的開(kāi)放閱讀框逐個(gè)進(jìn)行翻譯比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高致病性PRRSV變異株之間氨基酸同源性很高，并且遺傳特征相同，推測(cè)高致病性PRRSV變異毒株來(lái)源于同一個(gè)祖先［13-14］。

此次分離到的HEB-2013株具備了和高致病性PRRSV變異株比較相似的基因特征，根據(jù)華北地區(qū)近年來(lái)流行的PRRSV全序列基因組進(jìn)化樹(shù)以及NSP2、GP3、GP5基因氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)我國(guó)華北地區(qū)流行的PRRSV，可以分為兩個(gè)亞群，為了便于分析，我們稱之為亞群1和亞群2，這兩個(gè)亞群中的毒株均為高致病性毒株，分析發(fā)現(xiàn)，亞群1中的毒株大部分是2009年以前所分離到的，而亞群2中大部分毒株是2009年以后分離到的，該研究中分離的HEB-2013株位于亞群1，說(shuō)明在我國(guó)PRRSV新的變異株不斷出現(xiàn)的同時(shí)，其變異之前的毒株并沒(méi)有消失，這對(duì)本來(lái)就很不樂(lè)觀的PRRSV防控更加增添了難度。但是更進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)亞群之間的差異很小，HEB-2013株與與TJ株最為相似，同源性為99.23%，與SX2009株差異最大，同源性為98.39%，所以這也從另一方面說(shuō)明近年來(lái)華北地區(qū)流行的PRRSV的突變率并不是很高。

對(duì)HEB-2013株與其他毒株的NSP2、GP3、GP5三個(gè)蛋白氨基酸序列進(jìn)行詳細(xì)比對(duì)分析之后，發(fā)現(xiàn)亞群1與亞群2在三個(gè)蛋白中都有一定差別，在NSP2蛋白中，亞群1和亞群2均有482位和534-562位的缺失，在495位亞群1為P，亞群2為L(zhǎng)，在509位亞群1為R，亞群2為Q，在510位亞群1為R，亞群2為F，在519位亞群1為S，亞群2為I；GP3蛋白中，在66位亞群1為I，亞群2為T；GP5蛋白中，在29位亞群1為V，亞群2為A，在34位亞群1為N，亞群2為S。由于亞群1和亞群2均為高致病性毒株，因此我們推測(cè)這些變異位點(diǎn)可能與PRRSV的毒力基因相關(guān)。根據(jù)亞群1和亞群2的這些差異，我們可以直接對(duì)新發(fā)現(xiàn)的毒株進(jìn)行亞型分類，這個(gè)特點(diǎn)對(duì)于研究PRRSV的遺傳進(jìn)化分析具有重要的意義。

毒力相關(guān)氨基酸的推測(cè)與變異分析結(jié)果顯示，該研究所分離的HEB-2013株與華北地區(qū)近年來(lái)流行的毒株內(nèi)的9個(gè)潛在毒力相關(guān)氨基酸位點(diǎn)［14］完全相同，而且其親緣關(guān)系又十分接近，說(shuō)明近年來(lái)華北地區(qū)PRRSV流行毒株在遺傳變異方面趨于穩(wěn)定，但是這些毒株的毒力相關(guān)氨基酸與經(jīng)典株BJ-4有較大差異，9個(gè)毒力相關(guān)氨基酸中只有3個(gè)與BJ-4株保持一致，另外6個(gè)潛在毒力相關(guān)氨基酸位點(diǎn)與BJ-4株不同，這6個(gè)發(fā)生突變的位點(diǎn)分別是ORF1a（331）、ORF1b（952）、ORF2（10）、ORF5（13）、ORF5（151）、ORF6（16），結(jié)合馬平等對(duì)CH-1a、VR2332、HUN4、JXA1、GD3毒株毒力相關(guān)氨基酸的推測(cè)與分析結(jié)果，我們可以進(jìn)一步證明PRRSV的毒力基因與這6個(gè)潛在毒力相關(guān)氨基酸相關(guān)。在對(duì)HEB-2013株與其他毒株的NSP2、GP3、GP5三個(gè)蛋白氨基酸序列進(jìn)行詳細(xì)比對(duì)分析中，也發(fā)現(xiàn)了除了前人提到過(guò)的9個(gè)潛在毒力相關(guān)氨基酸之外，還存在一些氨基酸變異，這些變異位點(diǎn)在高致病性毒株與弱毒株BJ-4株相比有差異，例如在GP3蛋白氨基酸序列中，第64位，高致病性毒株均為A，而B(niǎo)J-4為T；在GP5蛋白氨基酸序列中，第3位，高致病性毒株均為G，而B(niǎo)J-4為E，第24位，高致病性毒株為Y，BJ-4為C，第39位，高致病性毒株為I，BJ-4為L(zhǎng)，第137位，高致病性毒株為S，BJ-4為A。筆者認(rèn)為，這些在高致病性毒株中相同而與BJ-4又不同的位點(diǎn)有可能是研究者還沒(méi)發(fā)現(xiàn)的潛在毒力相關(guān)氨基酸位點(diǎn)，因此下一步研究將對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證分析，以確定它們是否與PRRSV的毒力相關(guān)。

由于PRRSV變異速度快，PRRSV基因序列的進(jìn)化率（10-2／位／年）明顯高于其他RNA病毒（10-3～10-5／位／年），而且PRRSV的變異分布于整個(gè)基因組，以NSP2基因和GP5基因變異最大。這使得豬繁殖與呼吸綜合征的防控十分困難，因此研制出針對(duì)不同變異株均有效的疫苗變得至關(guān)重要，該研究通過(guò)對(duì)華北地區(qū)近年來(lái)流行的PRRSV毒株進(jìn)行了遺傳變異分析，為我國(guó)PRRSV的防控提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

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（編輯：李文平）

Isolation and Sequence Analysis of PRRSV HEB-2013 Strain Isolated in China

ZHANG Dong-dong1，LIU Can2，GONG Wen-zhi1，NING Yi-bao1?，F(xiàn)AN Xue-zheng1，ZHANG Jin-ya1
（1.National Classical Swine Fever Reference Laboratory，China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In september 2013，we isolated a strain of PRRSV from a farm of Hebei province，named HEB-2013.After sequenced the whole genome，The results showed that the complete genome of HEB-2013 strain is 15336 nt，containing nine open reading frames（ORFs）with 189 nt in the 5’UTR and 165 nt in the 3’UTR.Then we compared the whole genome of this strain and complete nucleotide sequence of PRRSV isolated in Northern China which inquried on the NCBI.The results showed that the highest nucleotide homology is TJ strain isolated in 2006，the lowest is BJ-4 strain isolated in 2000，respectively is 99.80%and 88.39%.According to the amino acid sequence alignment results of NSP2，GP3 and GP5，we make a systematic analysis of the relation ship between the potential virulence sites and pathogenicity of the virus，and we have found five new likely sites related to the pathogenicity of virus.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；virus isolation；complete genome sequence analysis；the molecular characteristics

2014-12-03

A

1002-1280（2015）05-0005-07

S858.28

948項(xiàng)目（2130106）

張東東，碩士研究生，從事分子病毒學(xué)研究。

寧宜寶。E-mail：ningyibao＠ivdc.org.cn