液相色譜檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的方法改進研究

王麗娟，張驪，錢卓真，湯水粉，葉玫，吳成業(yè)

（1.福建省水產(chǎn)研究所，福建廈門361013；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

液相色譜檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的方法改進研究

王麗娟1，張驪2，錢卓真1，湯水粉1，葉玫1，吳成業(yè)1

（1.福建省水產(chǎn)研究所，福建廈門361013；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

采用正交試驗法考察液相色譜法檢測喹諾酮類藥物保留時間漂移現(xiàn)象的主要影響因素。以諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星保留時間的漂移率作為評價指標，考察流動相種類、前處理條件以及樣品種類等因素對喹諾酮類藥物保留時間的影響。結(jié)果表明，造成分析物色譜峰漂移的主要因素是流動相種類。在流動相中添加緩沖鹽和優(yōu)化前處理方法，可以明顯改善目標分析物保留時間的漂移，改進后諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星漂移率分別降低9.11%、7.74%和7.97%。通過實驗獲得最佳檢測條件，以期為基層檢測單位提供可選方法。

喹諾酮類藥物；保留時間；漂移；液相色譜

喹諾酮類抗生素是近二三十年來發(fā)展迅速且應用廣泛的廣譜抗菌藥物。此類藥物對大多數(shù)魚類易感染細菌的最低抑菌濃度（MIC）值較小，組織藥物濃度高，且分布廣泛，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的抗感染藥物之一，被廣泛應用于預防和治療魚類全身性細菌感染［1-2］。但是，此類藥物過量或者不正當使用造成的殘留會對人體健康有危害，例如具有光毒性［3］，肝和軟骨毒性［4］，可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)［5］和消化系統(tǒng)的不良反應，以及肌腱病癥［6］和對血糖代謝的影響［7］。我國于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種喹諾酮類藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500 μg／kg［8］。目前，水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）［9］和高效液相色譜法（HPLC）［10］。由于具有樣品前處理簡單、精密度好和儀器操作相對簡便等特點，HPLC方法在基層檢測機構(gòu)中得到廣泛應用。然而，在日常工作中發(fā)現(xiàn)，采用HPLC方法檢測水產(chǎn)品中的氟喹諾酮類藥物殘留時，可能會出現(xiàn)明顯的保留時間漂移，從而給陽性樣品的確認帶來困擾，干擾檢測結(jié)果。在本研究中，采用正交實驗方法考察各種HPLC方法中使用的流動相種類、前處理條件以及樣品種類等因素對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星保留時間的影響，探究造成檢測時間漂移的主要原因。在此基礎(chǔ)上，對實驗條件進行優(yōu)化，從而解決保留時間漂移的問題，為基層檢測單位改進水產(chǎn)中氟喹諾酮類藥物殘留的HPLC檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 waters e2695液相色譜儀，配waters 2475熒光檢測器（美國waters公司）；AB204-E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q Academic去離子水發(fā)生器（上海百微生物科技有限公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）；DT5-5低速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；KQ-6000DE數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；固相萃取柱裝置（美國奧泰科技有限公司）；固相萃取柱（Oasis HLB，Waters公司）；諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星標準品（德國DR.Ehrenstorfer GmbH），純度≥95.0%；甲醇、乙腈均為色譜純（美國Tedia公司）；四丁基溴化銨（國藥集團化學試劑有限公司）；其余試劑皆為分析純。

酸化乙腈：乙腈+（1+1）鹽酸＝2500+20（V／V）；0.01mol／L檸檬酸-三乙胺混合溶液：取2.1014 g的檸檬酸稀釋定容至1000 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至4.5［10］；0.05 mol／L磷酸-三乙胺混合溶液：取3.4 mL的濃磷酸稀釋定容至1000 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.4［11］；磷酸鹽緩沖溶液：取磷酸二氫鉀6.8001 g，加水使溶解并稀釋至500 mL，用5 mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 儀器條件 色譜柱：Agilent色譜柱，Eclipse XDB-C18柱，5 μm，4.6 mm（id）×150 mm；流速1.0 mL／min，檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長460 nm；柱溫35℃；進樣量10 μL；流動相：乙腈+檸檬酸-三乙胺溶液＝14+86（V／V），乙腈+磷酸-三乙胺溶液＝14+86（V／V），乙腈+四丁基溴化銨＝6+94（V／V）。

1.3 方法

1.3.1 不同樣品前處理方法 液液萃取法：準確稱取5 g（精確到0.01 g）樣品，依次加入10～15 g的無水硫酸鈉和30 mL酸化乙腈，超聲提取5 min，4000 r／min離心10 min，取上清液。往殘渣中加入15 mL酸化乙腈，重復上述操作一次，合并上清液。將上清液置于分液漏斗中，加入25 mL正己烷，震蕩，充分靜置，取下層乙腈層轉(zhuǎn)入燒瓶，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1.0 mL流動相充分溶解殘渣，加入1.0 mL正己烷渦旋洗滌后，移入5 mL離心管，8000 r／min離心后取下層，經(jīng)濾膜過濾后，供液相色譜分析。

固相萃取法：如前所述，采用酸化乙腈提取兩次，合并上清液轉(zhuǎn)入燒瓶，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL磷酸二氫鉀-甲醇溶液充分溶解殘渣備用。固相萃取柱先依次用甲醇、水各3 mL預活化，取備用樣品5 mL過柱，用5 mL水淋洗、擠干。用6 mL的6%的氨化甲醇洗脫擠干，收集洗脫液，于45℃氮氣吹干，準確加入1.0 mL流動相溶液溶解殘渣，經(jīng)濾膜過濾后，供液相色譜分析。

液液萃取法與固相萃取法結(jié)合：如前所述，酸化乙腈超聲提取兩次合并置于分液漏斗中，加入正己烷靜置分層后移出旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用5 mL流動相充分溶解殘渣，過HLB固相萃取柱（同固相萃取法）。用1.0 mL流動相溶液溶解殘渣，經(jīng)濾膜過濾后，供液相色譜分析。

1.3.2 正交實驗設計 為考察各因素影響的顯著性，得出影響喹諾酮類藥物保留時間漂移的最關(guān)鍵因素，本研究進行L9（34）正交實驗設計。即以樣品種類（A）、前處理方法（B）、流動相種類（C）為考察因素，設計3因素3水平的正交實驗，每組實驗重復三次。正交實驗因素與水平設計見表1。

表1 因素水平表

1.3.3 漂移率的計算 樣品中喹諾酮類藥物色譜峰保留時間漂移率可由下式計算：×100%，式中，S為漂移率（%）；T1為樣品中喹諾酮類藥物保留時間（min）；T2為喹諾酮類標準品保留時間（min）。

1.3.4 方法改進 對6例實際樣品進行檢測，四丁基溴化銨／乙腈做為流動相時，在流動相中加入0.02 mol／L磷酸鹽緩沖溶液（pH＝3.0），觀察改進前后3種喹諾酮類藥物保留時間。

2 結(jié)果

2.1 正交實驗結(jié)果 結(jié)果如表2、表3所示。

表2 L9（34）正交實驗方案表

表3 正交實驗數(shù)據(jù)直觀分析表

由表2、表3分析結(jié)果可知，造成諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的保留時間漂移主次因素分別為C＞A＞B，即流動相種類＞樣品種類＞前處理條件。當采用液液萃取法進行樣品前處理，并使用四丁基溴化銨作為流動相時，南美白對蝦樣品中諾氟沙星和環(huán)丙沙星的保留時間較標準品出現(xiàn)了明顯的漂移（圖1）。

2.2 顯著性分析 結(jié)果如表4所示。

圖1 喹諾酮類藥物液相色譜圖（a標準品，100 ng／mL；b南美白對蝦樣品）

表4 方差分析表

通過表4方差分析進一步證明，流動相種類對其出峰時間漂移率影響最大。而對于不同的樣品種類，基質(zhì)的復雜性和酸堿度等可能有差別，因此，不同的前處理條件對喹諾酮類藥物保留時間漂移的影響也不可忽視。

2.3 改進后結(jié)果 改進前、后不同樣品中3種喹諾酮類藥物保留時間漂移率結(jié)果，見表5。從SPSS軟件處理后的結(jié)果（表6）可看出，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星（P＜0.05）改進前后保留時間漂移率具有顯著性差異。方法進行改進后，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的保留時間漂移率分別降低了9.11%、7.74%和7.97%，且改進后的3種喹諾酮類藥物保留時間的漂移率皆低于2%，從而滿足檢測要求。

表5 改進流動相后樣品檢測結(jié)果%

表6 改進前后諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星SPSS軟件處理結(jié)果%

3 討論及小結(jié)

由于喹諾酮類藥物的結(jié)構(gòu)中同時包含有哌嗪基和羧基，屬于兩性分子，傳統(tǒng)的色譜柱常常會因為殘余硅醇基和金屬不純物的存在而導致色譜峰拖尾［11-12］。在某些檢測方法中，通常在流動相中加入四丁基溴化銨試劑［10-14］作為離子對試劑降低其極性，從而改善峰形和提高分離度。但喹諾酮類樣品在色譜柱保留時間對pH值很敏感，而離子對試劑本身無法起到有效的緩沖作用［15-16］，可能造成不同樣品分析物保留時間的漂移。因此本試驗發(fā)現(xiàn)流動相種類是導致HPLC保留時間漂移的主要原因。當流動相為乙腈-四丁基溴化銨溶液時，諾氟沙星和環(huán)丙沙星的保留時間漂移加大。而流動相中加入緩沖溶液后，羅非魚陽性樣品中環(huán)丙沙星保留時間漂移率減小為1.20%，而未加前環(huán)丙沙星保留時間漂移率為9.86%，因此在實際樣品的檢測中，保留時間的漂移得到明顯改善，從而消除了樣品的pH值不同對喹諾酮類藥物的HPLC保留時間的影響。另外，采用四丁基溴化銨試劑做為流動相時，色譜柱的平衡時間較長，也可能會影響保留時間的重復性。

通過直觀分析發(fā)現(xiàn)除了流動相種類的影響其次為樣品種類，而對于水產(chǎn)品來說，不同樣品所含基質(zhì)不同，且樣品pH值也有差別。因此樣品種類對檢測時間漂移率的影響可歸結(jié)為樣品前處理影響和樣品pH對流動相的影響（如上述可通過加入緩沖鹽改善）。在HPLC分析前，如果樣品前處理過程的凈化效果不好，進樣溶液中強保留基質(zhì)組分可能會造成目標分析物在色譜柱上的保留時間不穩(wěn)定，同時，本研究的結(jié)果表明，樣品前處理也是影響喹諾酮類藥物保留時間漂移的因素之一。在水產(chǎn)中喹諾酮類藥物的多殘留檢測時，固相萃取在樣品凈化方面具有明顯優(yōu)勢，并得到普遍應用［17-22］。因此，在本文研究中，在前處理過程中，采用固相萃取法對樣品進行凈化，也是防止保留時間漂移的手段之一。

在本文中，采用正交實驗設計和顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在采用HPLC法檢測水產(chǎn)品中的喹諾酮類藥物殘留時，造成分析物色譜峰漂移的主要因素是流動相種類。同時，樣品前處理方法也是影響因素之一。根據(jù)以上結(jié)果，采用四丁基溴化銨作為流動相時通過在流動相中添加緩沖鹽和優(yōu)化前處理方法，可以明顯改善目標分析物保留時間的漂移，從而避免實際檢測中對可能陽性樣品的錯誤判斷。

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（編輯：侯向輝）

Improvements of Retention Time of Quinolones in Liquid Chromatography

WANG Li-juan1，ZHANG Li2，QIAN Zhuo-zhen1，TANG Shui-fen1，YE Mei1，WU Cheng-ye1
（1.Fujian Fisheries Research Institute，Xiamen，F(xiàn)ujian 361013，China；2.China Institute of Veterinary Drugs Control，Beijing 100081，China）

Orthogonal test was employed to investigate the factors affecting retention time shift of quinolones in liquid chromatography.Retention time drift rate of norfloxacin，ciprofloxacin and enrofloxacin was used as evaluation criteria，and species of mobile phase，pretreatment conditions，sample types were investigated.It was shown that species of mobile phase was the main factor which affected retention time strongly.Retention time shift rate had obvious difference for norfloxacin，ciprofloxacin and enrofloxacin before and after adding the buffer salt mobile phase and optimizing the pretreatment conditions.The improved retention time drift rate reduced by 9.11%，7.74%and 7.97%respectively.Through this experiment，stable retention time of norfloxacin，ciprofloxacin and enrofloxacin by liquid chromatography was obtained，and the best detection method was attained.

quinolones；rentention time；shifts；liquid chromatography

2014-11-29

A

1002-1280（2015）05-0037-06

S859.84

福建省水產(chǎn)研究所青年科學研究創(chuàng)新基金項目（2014fjscq02）

王麗娟，博士，從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全和漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測研究。E-mail：wangguoqinli＠163.com

張驪，碩士，從事獸藥殘留監(jiān)測分析研究。E-mail：zhangli＠ivdc.org.cn