HPLC-MS／MS法檢測血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

楊娟，謝紅旗，2?，曾建國，2?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地聯(lián)合工程中心，長沙410128 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128）

HPLC-MS／MS法檢測血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

楊娟1，謝紅旗1，2?，曾建國1，2?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地聯(lián)合工程中心，長沙410128 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128）

為了建立給雞灌胃血根堿后同時測定雞血漿中血根堿及二氫血根堿濃度的HPLC-MS／MS檢測方法，并評價血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，采用甲醇提取雞血漿中的血根堿及代謝物二氫血根堿，以0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相，選用Agilent Poroshell 120 EC C18（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）色譜柱進行色譜分離，采用電噴霧離子源（ESI）三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進行檢測。血根堿及代謝產(chǎn)物二氫血根堿均在0.1～50.0 ng／mL濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系，提取回收率分別為88.95%～95.81%和82.00%～87.00%；日內(nèi)及日間精密度（RSD）均小于15%；血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax，Tmax，MRT，CL分別為0.90± 1.053 ng／mL、0.38±0.30 h、5.11±0.74 h和44.09±3.05 h。血根堿在雞體內(nèi)血藥達峰時間以及滯留在體內(nèi)的平均時間較短，代謝物二氫血根堿的血藥濃度是血根堿的血藥濃度5.74倍，說明代謝物二氫血根堿的血藥濃度遠大于血根堿的血藥濃度。該方法具有快速、靈敏度高、專屬性強等特點，適用于同時測定雞血漿中血根堿和二氫血根堿的血藥濃度。

血根堿；二氫血根堿；雞；藥代動力學(xué)

博落回（Macleaya cordata（Wild.）R.Br）為罌粟科博落回屬多年生直立草本植物，其提取物已被成功開發(fā)為首個植物源性二類新獸藥藥物飼料添加劑。血根堿（sanguinarine，SA）是博落回中的最主要的活性成分［1］，是季胺苯并菲啶類生物堿（QBAs），屬于芐基異喹啉類生物堿中的一種；二氫血根堿（Dihydrosanguinarine，DHSA）屬于異喹啉類生物堿主要存在于罌粟科博落回屬［2］。已有文獻報道采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chomatography，HPLC）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LiquidChromatograph／MassSpectrometerTriple Quad，HPLC-MS）方法對博落回植物中的四種主要生物堿血根堿、別隱品堿、原阿片堿以及白屈菜紅堿進行了測定［3-4］，貝俊宏等［5］采用硫酸銨梯度法測定了血根堿脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)規(guī)律，但血根堿在禽類動物的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究尚未見報道。

本文通過系統(tǒng)地方法學(xué)考察，建立了同時測定雞血漿樣品中的血根堿和二氫血根堿的HPLCMS／MS方法并對其在雞血漿中代謝動力學(xué)參數(shù)進行分析。該方法的建立可用于監(jiān)測血根堿和二氫血根堿在動物體內(nèi)的動態(tài)血藥濃度，對研究血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)［6］和藥效動力學(xué)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 一日齡肉雞20只雌雄各半，體重25～30 g由湖南畜牧研究所提供，雞以基礎(chǔ)飼料（由麥麩、玉米、大麥、稻谷、高粱等）喂養(yǎng)，飼喂60天左右，平均體重為1.12 kg。甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、水為Milli-Q超純水。血根堿對照品（批號：510001-201101，中國食品藥品檢定研究院，≥98.0%）；二氫血根堿對照品（批號：201302，湖南美可達生物資源有限公司提供，≥98.0%）。

1.2 儀器 6460型高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；1730R低溫高速離心機（Hermle公司）；Agilent Poroshell 120 EC C18色譜柱（美國Agilent公司）；UGC 45C型氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；QL-901型渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；DAS3.0藥代動力學(xué)軟件。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 準確稱取一定量的血根堿（SA）和二氫血根堿（DHSA）對照品，用甲醇溶解后將其定容成質(zhì)量濃度為100.0 ng／mL的對照品儲備液。繼續(xù)用甲醇稀釋為分別含有SA和DHSA質(zhì)量濃度為0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 ng／mL的混合對照溶液，冰箱4℃內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 色譜條件 根據(jù)參考文獻［7］方法并改進，確定為：采用Agilent Poroshell 120 EC C18（2.1×150 mm，2.7 μm）色譜柱，流動相為0.2%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，28%～50%B；4～6 min，50%～65%B；6～12 min，65%B；12～20 min，65%～28%B；20～25 min，28%B；柱溫為35℃；流速為0.3 ng／mL；進樣量為2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式，噴霧電壓：35 psi，毛細管電壓：4000 V，干燥氣的溫度：350℃，EMV：200 V，脫溶劑氣和霧化氣均為氮氣，干燥氣流量：10 L／min，霧化氣壓力：45 psi，檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。碰撞能量、定性離子對及定量離子對等參數(shù)如表1所示。

表1 血根堿和二氫血根堿的色譜保留時間和定性、定量離子參數(shù)

1.3.4 給藥方案和血樣采集 肉雞6只，以濃度為30 mg／kg的劑量［8］灌胃給予血根堿的蒸餾水溶液，給藥前禁食不禁水12 h，期間使其自由飲水。給藥前取雞空白血，給藥后分別于0.25、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、5、8、10、24 h雞翅靜脈叢取血0.5 mL，于加有50 μL1%的肝素鈉生理鹽水溶液的EP管內(nèi)，3500 rpm離心10 min，使血漿分離，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，冰箱-20℃保存。

1.3.5 血漿樣品預(yù)處理 取雞血漿100 μL置于1.5 mL EP管中，加入500 μL甲醇，渦旋4 min，充分沉淀蛋白；13000 rpm離心12 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中；再往沉淀中分別加入500 μL甲醇，渦旋4 min，充分沉淀蛋白。13000 rpm離心12 min，取上清液。合并兩次上清液，于50℃水浴氮氣吹干，所得殘渣以200 μL甲醇溶解，渦旋2 min混勻，13000 rpm離心12 min，取上清液過0.22 μm的膜之后用于HPLC-MS／MS分析，記錄色譜圖。

1.3.6 方法學(xué)考察 試驗對色譜質(zhì)譜條件進行了方法學(xué)的考察，分別有：方法的專屬性、標準曲線與定量下線、提取回收率、準確度和精密度以及穩(wěn)定性的考察。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 將所得的SA在雞體內(nèi)的血藥濃度-時間關(guān)系用DAS 3.0藥代動力學(xué)軟件處理，計算SA在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)結(jié)果 經(jīng)方法學(xué)的考察，結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，SA和DHSA可實現(xiàn)很好的分離見圖1，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾待測物質(zhì)SA和DHSA的測定，表明本方法專屬性良好。經(jīng)擬合得線性回歸方程分別為SA：y＝179.85x+34.079，R2＝0.9997；DHSA：y＝322.07x+32.972，R2＝0.9998；結(jié)果表明該方法在0.1～50.0 ng／mL范圍內(nèi)SA和DHSA的線性關(guān)系良好，SA和DHSA的定量下限均為0.067 ng／mL。經(jīng)測定，該方法兩種生物堿的低、中、高三個濃度的提取平均回收率分別為90.2±5.1%，85.2±2.5%，均大于80%，均符合生物樣品分析方法要求。日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD分別為3.4%和4.7%，準確度（RE）結(jié)果見表2，結(jié)果（表2）表明該分析方法具有良好的準確度和精密度。經(jīng)處理后的血漿樣品室溫放置10 h后血漿濃度的RE在±8.93%內(nèi)，-20℃冰箱保存20 d血漿濃度的RE在±12.34%內(nèi)，可保證樣品的分析測定。

圖1 （a）雞空白血漿樣品、（b）雞空白血漿加標準品、（c）給藥后雞血漿樣品的代表性色譜圖

2.2 血根堿及其代謝物二氫血根堿的藥-時曲線以及血根堿的主要藥代動力學(xué)參數(shù) 雞灌胃血根堿，按上述時間點采集血樣，經(jīng)處理后進行LC-MS分析。雞血漿樣品測定過程中，進行雙樣本分析，每天隨行一條標準曲線，同時伴隨測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控血漿樣品。只有當QC樣品RSD＜15%時，當日取得的數(shù)據(jù)可接受。根據(jù)不同時間點的數(shù)據(jù)，對血根堿及代謝物二氫血根堿在雞血漿內(nèi)隨時間的濃度變化進行分析見圖2，并計算了血根堿的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。

表2 雞血漿中血根堿測定方法的準確度

表3 雞灌胃30 mg／kg血根堿后主要藥代動力學(xué)參數(shù)

圖2 雞單次灌胃血根堿后的SA及代謝物DHSA平均血藥濃度-時間曲線（mean±SD，n＝6）

3 討論與小結(jié)

研究表明，血根堿經(jīng)具有抗菌、殺蟲、改善肝功能和抗腫瘤等藥理作用，可抑制膽堿酯酶活性，加強心臟活動、刺激唾液分泌，并具有利尿、外周抗腎上腺素解交感作用。而目前有關(guān)血根堿的研究報道，絕大多數(shù)都是集中在血根堿提取分離方法、藥理作用方面，缺少相關(guān)的臨床前研究資料，尤其是關(guān)于其藥物動力學(xué)及其代謝資料。所以，探討血根堿作為中獸藥在動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)行為，有利于弄清其藥理作用機理及作用過程，對于指導(dǎo)新藥設(shè)計，提高新藥療效和安全性，科學(xué)地制定藥品質(zhì)量標準均具有重要意義。為促進血根堿新藥的開發(fā)和利用，更好地了解血根堿藥理作用的機理及過程，對血根堿在動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)過程進行相關(guān)研究是很有必要的。

本試驗結(jié)果顯示，雞灌胃給藥后，血根堿在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax、Tmax、MRT、CL分別為0.90±1.053 ng／mL、0.38±0.30 h、5.11±0.74 h和44.09±3.05 h；說明雞在灌胃15 min后達到最大血藥濃度濃可達0.90±1.053 ng／mL，隨后隨時間延長血藥濃度逐漸降低；而其MRT平均駐留時間為5.11±0.74 h，說明灌胃后血根堿滯留在體內(nèi)的平均時間較短；從血根堿及其代謝物二氫血根堿的藥時曲線可看出：兩者在雞體內(nèi)達到最大血藥濃度的時間相當，而代謝物二氫血根堿的血藥濃度遠大于血根堿的血藥濃度，有研究表明：血根堿在動物體內(nèi)的還原代謝物為二氫血根堿［9］，這說明在雞體內(nèi)血根堿在還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為二氫血根堿的形式存在；而代謝物二氫血根堿的血藥濃度是血根堿的血藥濃度5.74倍，這說明血漿中代謝物二氫血根堿的濃度最高值比血根堿的最高值要高。

植物源性藥物飼料添加劑博落回提取物散通過對靶動物雞灌胃后，在血漿中檢測到了其主要成分及其初級代謝物的殘留。而雞灌胃血根堿10 h之后，在雞血漿中基本檢測不到血根堿以及二氫血根堿的存在，說明其在雞體內(nèi)的代謝較快，至于其是否在其他組織和器官中有殘留，還有待進一步的研究。以30 mg／kg濃度的血根堿灌胃，試驗過程中雞未見明顯不良反應(yīng)或死亡，提示此劑量安全。后期還可對藥物濃度進行高、中、低劑量設(shè)置，來完善藥代動力學(xué)研究。

本試驗所建立的HPLC-MS方法能夠同時檢測血根堿以及其初級還原代謝產(chǎn)物，方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法具有專屬性好、準確度高、精密度好和靈敏度高等特點，故本方法適用于血根堿和二氫血根堿在動物體內(nèi)的血藥濃度的測定和藥代動力學(xué)研究。

［1］ 萬學(xué)攀.博落回生物堿成分分離及抑菌活性研究［D］.碩士學(xué)位論文.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

［2］ Tanahashi T，Zenk M H.phenanthridine alkaloids from Eschscholtzia californica cell suspension cultures［J］.J Nat Prod，1990，53（3）：579-586.

［3］ Ying-Zhuang Chen，Guo-Zhu Liu，Yao Shen，et al.Analysis of alkaloids in Macleaya cordata（Willd.）R.Br.using highperformance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry.［J］.J Chromatogr.A，2009，1216：2104-2110.

［4］Xu-Biao Luo，Bo Chen，Shou-ZhuoYao.Rapid determination of protopine，allocryptopine，sanguinarine and chelerythrine in fruits of Macleaya cordata by microwave-assisted solvent extraction and HPLC-ESI／MS.［J］.Phytochem Anal，2005，17（6）：431-438.

［5］ 貝俊宏，柯學(xué)，黃志峰，等.血根堿脂質(zhì)體的制備與大鼠體內(nèi)藥動學(xué)［J］.藥學(xué)與臨床研究，2010，18（1）：42-45.

［6］ El-Gendi A Y I，Atef M，Aziza M M.Pharmacokinetic and tissue distribution of doxycycline in broiler chickens pretreated with either：Diclazuril or halofuginone［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48：3209-3214.

［7］ 馮宋崗，曾建國.HPLC-MS／MS法檢測豬肉中苯并菲啶類生物堿的研究［J］.中國獸藥雜志，2014，48（4）：48-51.

［8］ 肖利.博落回提取物抗肝纖維化的藥效學(xué)及血根堿的藥動學(xué)研究［D］.碩士學(xué)位論文.長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［9］ Pavel Kosina，Jan Vacek.Identification of benzo phenanthridine metabolites in human hepatocytes by liquid chromatography with electrospray ion-trap and quadrupole time-of-flight mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011，10：1077-1085.

（編輯：陳希）

The Pharmacokinetics Study of Sanguinarine in Broiler using HPLC-MS／MS

YANG Juan1，XIE Hong-qi1，2?，ZENG Jian-guo1，2?
（1.National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Hunan Agricultural University，Changsha 410208，China；2.Hunan 2011 Co-Innovation Center for Utilization of Botanicals Functional Ingredients（Hunan），Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

To establish a sensitive HPLC-MS／MS method for simultaneous determination the concentration of sanguinarine and dihydrosanguinarine in broiler plasma after oral administration of sanguinarine，and the pharmacokineticcharacteristicsofsanguinarinewereevaluated.Sanguinarineanditsmetabolites dihydrosanguinarine were extracted from plasma with methanol，then separated on an Agilent Poroshell 120 EC C18 column using water-0.2%formic acid（A）and acetonitrile（B）as mobile phase.Electrospray ionization（ESI）source was applied and operated in multiple reaction monitoring（MRM）mode.The linear calibrationcurve was obtained in the concentration range of 0.1～50 ng／mL for sanguinarine and its metabolites dihydrosanguinarine，The extraction recoveries were 88.95%～95.81%and 82%～87%for sanguinarine and dihydrosanguinarine respectively.The inter-and intra-day precisions were less than 15%.The pharmacokinetic parameters of sanguinarine were as follows：Cmax＝0.90±1.053ng／mL，Tmax＝0.25±0.38h，MRT＝5.11±0.74 h，CL＝44.09±3.05 h.The time to peak of plasma and the average time of residence in the body were short；the plasma concentrations of metabolites dihydrosanguinarine is 5.74 times as high as that of sanguinarine；it shows that the plasma concentrations of metabolites dihydrosanguinarine is much higher than that of sanguinarine.The method was shown to be effective，convenient and suitable for simultaneous pharmacokinetic study of sanguinarine and dihydrosanguinarine in broiler plasma.

sanguinarine；dihydrosanguinarine；broiler；pharmacokinetic

2015-03-16

A

1002-1280（2015）05-0022-05

S859.79

湖南省科技重大專項（20121004FJ），國家科技支撐項目（2011BAD34B02）

楊娟，碩士研究生，從事功能產(chǎn)品的開發(fā)與評價方面研究。

曾建國，E-mail：ginkgo＠world-way.net；謝紅旗，E-mail：xiehongqi2006＠sohu.com