五種抗菌藥物從豬、雞飼料至有機(jī)肥中的藥物殘留遷移規(guī)律研究

吳劍平，張?chǎng)危畹つ?，?yán)鳳，周悅榕，顧欣

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103）

五種抗菌藥物從豬、雞飼料至有機(jī)肥中的藥物殘留遷移規(guī)律研究

吳劍平，張?chǎng)?，李丹妮，?yán)鳳，周悅榕，顧欣?

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103）

為研究抗菌藥物從飼料向畜禽糞肥轉(zhuǎn)移的殘留遷移規(guī)律，將40頭豬和200羽雞分為飼喂組和空白對(duì)照組進(jìn)行飼喂對(duì)照實(shí)驗(yàn)和糞便堆肥發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其中空白對(duì)照組使用普通全價(jià)飼料，飼喂組在飼料中加入鹽酸金霉素50 mg／kg、磷酸泰樂菌素50 mg／kg、磺胺對(duì)甲氧嘧啶各50 mg／kg、恩諾沙星150 mg／kg、二甲氧芐啶10 mg／kg，每日及時(shí)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便進(jìn)行采集，樣品經(jīng)提取和凈化后使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析定量。所得結(jié)果表明，豬、雞飼喂含多種抗生素飼料后糞便中可以檢出抗菌藥物原型，其可能進(jìn)入有機(jī)肥料發(fā)酵制作的環(huán)節(jié)。參照豬、雞糞便中排出抗菌藥物含量峰值建立模型對(duì)發(fā)酵期間糞肥中抗菌藥物含量進(jìn)行采樣測(cè)定，結(jié)果顯示，恩諾沙星、泰樂菌素和二甲氧芐啶在堆肥過(guò)程中會(huì)由于溫度升高和氧化作用發(fā)生降解，其半衰期在5周左右，到10周后其含量低于檢測(cè)限；但金霉素和磺胺對(duì)甲氧嘧啶被少量降解，殘留遷移風(fēng)險(xiǎn)較高。

抗菌藥物；畜禽糞便；殘留遷移規(guī)律；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；堆肥發(fā)酵

Key words：antibiotics；manure of livestock and poultry；migration regularity of residue；LC-MS／MS；compost fermentation

抗菌藥物一般是指具有殺菌或抑菌活性的藥物，包括各種抗生素、磺胺及磺胺增效劑類、氟喹諾酮類等化學(xué)合成藥物。從20世紀(jì)80年代初至今，我國(guó)畜牧業(yè)正逐漸向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展。大規(guī)模、集約化、高密度的畜禽養(yǎng)殖對(duì)動(dòng)物疫病防控提出了更高的要求，在此過(guò)程中抗菌藥物正扮演著越來(lái)越重要的角色，其中四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和氟喹諾酮類抗菌藥物常被用作飼料添加劑以起到疾病防治和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，稱之為抗菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑［1-3］。然而，這同時(shí)也帶來(lái)了濫用抗菌藥物的現(xiàn)象，2012年11月肯德基的供應(yīng)商山西粟海集團(tuán)“速成雞”事件被曝光，據(jù)報(bào)道在飼喂過(guò)程中涉及到11種藥物，其中主要為抗菌促生長(zhǎng)劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，抗菌藥物的濫用和具有廣譜耐藥性基因的“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生有一定聯(lián)系，另外土壤抗生素污染可對(duì)土壤微生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，甚至影響土壤肥力和植物生長(zhǎng)。而目前有研究表明通過(guò)有機(jī)肥堆肥熟化可以通過(guò)降解抗菌藥物而降低其對(duì)土壤環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)［5-6］，因此當(dāng)前研究多種抗菌藥物從飼料到有機(jī)肥的殘留遷移規(guī)律就有相當(dāng)?shù)谋匾浴?/p>

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters?UPLC-TQ MS，Masslynx?工作軟件）；高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；電子天平（Mettler AE240，瑞士）；VisiprepTM-DL型固相萃取裝置（Supelco，美國(guó)）；N-EVAP112氮吹儀（Orangaomation，美國(guó)）。

1.2 材料與試劑 二甲氧芐啶（99%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；恩諾沙星（99.8%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；金霉素（92%，DrEhrenstofer GmbH）；磷酸泰樂菌素（98%，DrEhrenstofer GmbH）；磺胺對(duì)甲氧嘧啶（99%，DrEhrenstofer GmbH）；乙睛（Merk，色譜純）；甲醇（Merk，色譜純）；氨水、醋酸、氫氧化鈉、硝酸鎂、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；Oasis?HLB固相萃取柱（3 mL／60mg，Waters）；McIlvaine-EDTA緩沖液（pH＝4.1，Sigma），去離子水（密理博公司Milli-Q，電阻率＞16 MΩ·cm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100日齡體重80 kg左右健康本地品種肉豬40頭；7～12周齡體重3 kg左右本地品種肉雞200羽。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 糞肥中多種抗菌藥物提取和富集凈化方法稱取樣品1 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL McIlvaine-EDTA（pH＝4.0）緩沖液，充分振蕩10 min，離心10 min（8000 r／min），取出全部提取液。重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，充分混勻并準(zhǔn)確吸取4.0 mL提取液，離心10 min（10000 r／min）待用。HLB固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取4 mL離心備用液過(guò)柱，依次用3 mL 5%甲醇溶液淋洗，3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40℃水浴下用氮?dú)獯抵两?，?.0 mL 0.1%甲酸甲醇溶液（85／15，V／V）溶解殘?jiān)?，溶液過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2.2 樣品中多種抗菌藥物殘留LC-MS／MS檢測(cè)條件 色譜柱：Agilent SB C18 RRHD 1.8 μm 2.1 mm×100 mm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；流速：0.3 mL／min，優(yōu)化的色譜梯度洗脫程序見表1。離子源：電噴霧正離子源；電離模式：正離模式（ESI+）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；電離電壓：3.5 kV；錐孔溫度：500℃；脫溶劑氣流：800 L／h；反吹氣（氮?dú)猓?0 L／h；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量見表2，5種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

表2 6種抗生素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

圖1 糞肥中5種抗生素10 ng／mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

2.3 豬、雞飼喂含抗菌藥物飼料對(duì)照實(shí)驗(yàn) 將選取的40頭100日齡本地肉豬分為兩組分欄飼養(yǎng)，每組20頭，其中A組為空白對(duì)照組，B組為飼喂實(shí)驗(yàn)組，具體飼喂情況見表3；將選取的200羽7～12周齡本地肉雞分為兩組分欄飼養(yǎng)，每組100羽，其中A組為空白對(duì)照組，B組為飼喂實(shí)驗(yàn)組，具體飼喂情況見表3。飼喂實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物連續(xù)飼喂含多種抗菌藥物飼料4 d后換回空白飼料飼喂3 d。每日對(duì)棚舍中靠近中心的4處和靠近邊角的4處隨機(jī)位置的糞便進(jìn)行8點(diǎn)采集，每份糞便樣品約50 g，混勻后常溫下晾干，棚舍在每日采樣后進(jìn)行清掃防止對(duì)第二天的糞便樣品造成污染。

表3 分組飼喂實(shí)驗(yàn)表

2.4 豬、雞飼喂含抗菌藥物飼料后糞便中原型藥物含量蓄積與消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按2.3豬、雞飼喂含抗菌藥物飼料對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將每日所采集到的豬、雞糞便樣品按2.1與2.2所描述的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果以天數(shù)（d）為橫坐標(biāo)，藥物含量（μg／kg）為縱坐標(biāo)，將每天糞便中原藥含量的均值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作圖，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行含抗菌藥物飼料的飼喂可導(dǎo)致豬、雞排出的糞便中含較高含量的抗菌藥物；而停止飼喂后其排出糞便中的抗菌藥物的含量也逐漸消除至空白水平，因此可以證明飼料中抗菌藥物的超量使用是導(dǎo)致畜禽糞肥中的多種類抗菌藥物殘留的直接原因。另外，雖然不同的抗菌藥物在豬、雞糞便中殘留量的消除情況有所不同，但是除鹽酸金霉素外另外4種藥物在停止飼喂后7d內(nèi)均達(dá)到了與空白對(duì)照組相當(dāng)?shù)暮克健?/p>

圖2 豬、雞糞便中抗菌藥物含量的積累和消除結(jié)果

2.5 豬、雞糞便堆肥發(fā)酵過(guò)程中抗菌藥物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將空白豬、雞糞便分別收集后自然風(fēng)干，加入2.4實(shí)驗(yàn)中各種藥物峰值時(shí)糞便中藥物的含量（為方便稱量計(jì)算選取近似整數(shù)值）后分別混勻作為一個(gè)研究模型，具體添加量見表4。每組取約100 kg，在地上堆成半徑約為0.50 m，高度為0.40 m圓錐型糞堆，覆蓋塑料薄膜進(jìn)行發(fā)酵，每周對(duì)糞堆進(jìn)行6個(gè)不同位置的溫度測(cè)定和樣品采集，并按2.1和2.2進(jìn)行抗菌藥物含量測(cè)定，所得結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中恩諾沙星、泰樂菌素和二甲氧芐啶在堆肥過(guò)程中會(huì)由于溫度升高和氧化作用發(fā)生降解，其半衰期在5周左右，到10周后其含量低于檢測(cè)限；金霉素和磺胺對(duì)甲氧嘧啶被少量降解，殘留比例較高。

表4 豬、雞含抗菌藥物糞便模型的制作

圖3 豬、雞糞便堆肥發(fā)酵過(guò)程中抗菌藥物降解規(guī)律

3 討論

3.1 抗菌藥物從飼料向畜禽糞便的遷移 通過(guò)豬、雞飼喂含抗菌藥物飼料后糞便中原型藥物含量蓄積與消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，飼喂含抗菌素的飼料是導(dǎo)致畜禽糞便中抗菌藥物殘留蓄積的直接原因。本次實(shí)驗(yàn)所選擇的抗菌藥物包含了氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類及磺胺增效劑類，均屬于目前畜牧業(yè)常用的抗菌促生長(zhǎng)劑，實(shí)驗(yàn)選擇的飼喂量也是選取了常用劑量的最大值，而使用此劑量的抗菌藥物已經(jīng)使畜禽糞便中原藥造成殘留蓄積。另外，不同的藥物也體現(xiàn)出了不同的殘留蓄積與消除規(guī)律，不同動(dòng)物也會(huì)對(duì)飼喂同種藥物體現(xiàn)出不同的殘留蓄積規(guī)律。比如恩諾沙星在豬糞和雞糞中的殘留檢出量差異較大，推測(cè)是由于禽畜體內(nèi)消化器官和代謝酶系的巨大差異造成。本次實(shí)驗(yàn)中停止用藥后除鹽酸金霉素外另外幾種藥物在糞便中的檢出均在7 d內(nèi)回到了空白水準(zhǔn)，因此停止用藥約一周后的畜禽糞便中抗菌藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)較低。通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中超量使用抗菌藥物是導(dǎo)致畜禽糞便中抗菌藥物殘留蓄積的主要原因，因此在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免超劑量、超范圍使用抗菌藥物，而使用抗菌藥物后一周內(nèi)的畜禽糞便也具有較高的抗菌藥物殘留量，不宜直接進(jìn)行有機(jī)肥的制作。

3.2 抗菌藥物從畜禽糞便向有機(jī)肥的遷移 通過(guò)豬、雞的含抗菌素飼料飼喂實(shí)驗(yàn)獲得了其糞便中各種抗菌藥物殘留量的峰值，以此峰值建立了其含抗菌藥物糞便模型，通過(guò)對(duì)該模型的堆肥發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，可知恩諾沙星、泰樂菌素和二甲氧芐啶大部分被降解，其通過(guò)有機(jī)肥進(jìn)入土壤環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低；但金霉素和磺胺對(duì)甲氧嘧啶被少量降解，其殘留通過(guò)有機(jī)肥進(jìn)入土壤的風(fēng)險(xiǎn)較高，該結(jié)果與所查文獻(xiàn)［8］中4種磺胺類抗菌藥降解的降解率最低為9.83%的結(jié)果有一定相似性。推測(cè)主要是由于氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺增效劑對(duì)環(huán)境的pH和溫度變化較為敏感，容易發(fā)生水解或氧化而導(dǎo)致其含量下降較多；四環(huán)素類雖然也容易發(fā)生水解，但由于用量高，最終在有機(jī)肥中仍有較多殘留；大部分磺胺類藥物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度不敏感，不易在糞肥發(fā)酵過(guò)程中降解。本次研究表明，在飼料中超劑量使用金霉素和磺胺對(duì)甲氧嘧啶會(huì)造成其由畜禽通過(guò)機(jī)肥途徑向環(huán)境土壤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)盡可能減少其不以治療為目的而在動(dòng)物飼料中進(jìn)行超劑量使用。

3.3 展望 本次研究選取的恩諾沙星、鹽酸金霉素、磷酸泰樂菌素、磺胺對(duì)甲氧嘧啶和二甲氧芐啶均屬于目前畜牧業(yè)常用的抗菌促生長(zhǎng)劑，涵蓋了氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類及磺胺增效劑類。之前研究表明［9-10］，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是快捷準(zhǔn)確的多殘留檢測(cè)方法，適合對(duì)多種目標(biāo)化合物同時(shí)進(jìn)行定性定量測(cè)定。利用該方法，通過(guò)飼喂實(shí)驗(yàn)與糞便堆肥實(shí)驗(yàn)可以研究其從養(yǎng)殖環(huán)節(jié)到種植環(huán)節(jié)的殘留遷移規(guī)律，為評(píng)價(jià)畜禽養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用對(duì)環(huán)境的影響和對(duì)細(xì)菌耐藥性問題的成因提供基礎(chǔ)。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)明確了飼料中抗菌藥物是造成畜禽糞肥中抗菌藥物殘留的主要原因，并且部分藥物會(huì)通過(guò)由畜禽糞便堆肥制作有機(jī)肥的過(guò)程進(jìn)入環(huán)境土壤的殘留遷移途徑。下一步將通過(guò)對(duì)環(huán)境土壤和所種植物建立模型進(jìn)行研究，以確定其是否有經(jīng)過(guò)土壤向所種植物進(jìn)行殘留遷移的可能。另一方面，對(duì)含抗菌藥物的畜禽糞便、有機(jī)肥以及土壤中含耐藥性基因細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，以研究抗菌藥物的殘留遷移是否與環(huán)境細(xì)菌的耐藥性有所聯(lián)系，這個(gè)研究有可能發(fā)現(xiàn)對(duì)耐藥性細(xì)菌成因的傳統(tǒng)見解以外的新途徑。

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（編輯：李文平）

Research on the Migration Regularity of 5 Antibiotics Residue from Swine and Chicken Feedstuff to Organic Fertilizer

WU Jian-ping，ZHANG Xin，LI Dan-ni，YAN Feng，ZHOU Yue-rong，GU Xin?
（Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstaff，Shanghai 201103，China）

To determine the migration regularity of antibiotics residue from swine and chicken feedstuff to organic fertilizer，40swines and 200 chickens were selected and divided into two groups to do the feeding tests and fermentation experiments.The blank group was fed with only complete feed，while the test group was fed with the complete feed with 50 mg／kg chlortetracycline hydrochloride，50 mg／kg tylosin phosphate，50 mg／kg sulfametoxydiazine，150 mg／kg enrofloxacin and 10 mg／kg trimethoprim.The manure was collected in time every day，and the sample was extracted and purified，before it was analyzed by the LC-MS.The results indicated that the antibiotics residue could be tested in manure after the swine and chicken were fed with antibiotics feedstuff，and it was able to enter the manufacture of organic fertilizer.The manure models were established according to the top value of the antibiotics residue in test group manure.The fermentation experiments were done to determine the residue of antibiotics in manure.The results indicated that enrofloxacin，tylosin phosphate and trimethoprim would be degraded by the rise of temperature and oxidation with a half-life of 5 weeks and they would be lower than limit of detection after 10 weeks.But chlortetracycline hydrochloride and sulfametoxydiazine would be less degraded with a higher risk of residue migration.

2015-03-16

A

1002-1280（2015）05-0043-06

S859.79+6

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2011）第4-9號(hào)）

吳劍平，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留檢測(cè)研究。

顧欣。E-mail：guxun＠sh163.net