叔丁基對(duì)苯二酚激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白酶體活性延緩復(fù)制性衰老*

宋慧芳，楊佳超，牛曉潔，陸　利(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西太原030001)

叔丁基對(duì)苯二酚激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白酶體活性延緩復(fù)制性衰老*

宋慧芳，楊佳超，牛曉潔，陸利△
(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西太原030001)

［摘要］目的:探討叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)在延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)制性衰老進(jìn)程中的作用，以期為細(xì)胞移植治療提供數(shù)量充足的種子細(xì)胞。方法: 30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于體外傳代晚期BMSCs 4周，化學(xué)發(fā)光法測(cè)量蛋白酶體活性; CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力; BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布;衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測(cè)衰老細(xì)胞百分比; Western blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P53表達(dá)變化。結(jié)果: 30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于傳代晚期BMSCs 4周后，蛋白酶體活性較DMSO溶劑對(duì)照組上調(diào)(21.96±1.98) % (P＜0.05)。CCK-8法顯示隨tBHQ濃度增加，細(xì)胞活力逐漸升高，至40 μmol/L達(dá)到平臺(tái)期，且至120 μmol/L未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示tBHQ組陽(yáng)性細(xì)胞率與DMSO溶劑對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖能力顯著提高(P＜0.05) ; tBHQ組細(xì)胞增殖指數(shù)也顯著高于DMSO組(P＜0.05)。tBHQ組SA-β-Gal陽(yáng)性率較DMSO溶劑對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，且衰老相關(guān)蛋白P53表達(dá)量也較對(duì)照組下降(P＜0.05)。結(jié)論: tBHQ能夠通過(guò)提高蛋白酶體活性延緩因蛋白酶體功能障礙引起的BMSCs復(fù)制性衰老進(jìn)程。

［關(guān)鍵詞］叔丁基對(duì)苯二酚;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;復(fù)制性衰老

［修回日期］2015-04-07

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易分離培養(yǎng)、擴(kuò)增純化、便于自體移植等特點(diǎn)，是醫(yī)學(xué)組織工程理想的種子細(xì)胞［1-2］。分離獲得的BMSCs數(shù)量有限，需體外擴(kuò)增后用于移植治療。然而，在擴(kuò)增培養(yǎng)中BMSCs出現(xiàn)復(fù)制性衰老［3-4］。我們近期的研究結(jié)果提示，蛋白酶體功能障礙是誘發(fā)BMSCs復(fù)制性衰老的重要因素［5］;過(guò)表達(dá)蛋白酶體功能亞單位PMSB5，提高蛋白酶體活性，能夠延緩BMSCs衰老進(jìn)程［6］。

叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)是一種人工合成的酚類強(qiáng)抗氧化劑，常作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于油脂食品中阻止食物油脂氧化變質(zhì)。已有研究證明tBHQ可以通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體活性［7-9］。因此，本研究擬探討tBHQ對(duì)BMSCs細(xì)胞活力的影響，尋求抑制細(xì)胞衰老進(jìn)程的有效手段。

材料和方法

1 BMSCs的體外培養(yǎng)

BMSCs購(gòu)于Science Cell Research Laboratory，用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含2 mmol/L L-谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化，1∶2傳代。晚期BMSCs即體外擴(kuò)增14代以上的細(xì)胞，已出現(xiàn)復(fù)制性衰老表型［5］。

2主要方法

2.1tBHQ干預(yù)實(shí)驗(yàn)30 μmol/L tBHQ持續(xù)作用于晚期BMSCs 4周，干預(yù)完成后即刻進(jìn)行下游相關(guān)實(shí)驗(yàn); DMSO組為同樣濃度的溶劑對(duì)照組，持續(xù)作用4周。

2.2蛋白酶體活性測(cè)定Lysis buffer提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，APT280試劑盒(Millipore)測(cè)定20S蛋白酶體活性。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:避光96孔板中將30 μg蛋白與熒光底物混合至終體積100 μL，37℃避光孵育1.5 h，熒光光度計(jì)在380/460 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度反映蛋白酶體活性。

2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力各組細(xì)胞以相同密度接種于96孔板(每孔2 000 個(gè))，細(xì)胞貼壁后按檢測(cè)試劑盒操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(A)值。

2.4BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力細(xì)胞貼壁后，用含有10 μmol/L BrdU的10% FBS-DMEM培養(yǎng)72 h，4%多聚甲醛室溫固定20 min，2 mol/L鹽酸37℃水浴作用10 min使DNA變性，而后小鼠抗BrdU I 抗(1∶100，ABtech) 4℃孵育過(guò)夜，山羊抗小鼠熒光II 抗(1∶100) 37℃避光孵育2 h，DAPI室溫染核10 min，水溶性封片劑封片。Olympus熒光顯微鏡拍片、計(jì)數(shù)。

2.5碘化丙啶染色，流式細(xì)胞術(shù)觀察BMSCs細(xì)胞周期分布和細(xì)胞增殖指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化，PBS清洗2次，棄上清，輕彈管壁使細(xì)胞團(tuán)分散后，快速加入2 mL預(yù)冷的70%乙醇固定4 h，1 000 r/min室溫離心5 min，PBS清洗1次，而后300目濾網(wǎng)過(guò)濾去除雜質(zhì)，1 000 r/min室溫離心5 min收集細(xì)胞，加入碘化丙啶工作液(50 mg/L碘化丙啶，10 mg/L RNase，1‰Triton X-100)，室溫避光孵育20 min，而后流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞分布，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferative index，PI)。

2.6衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senscence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測(cè)細(xì)胞衰老水平細(xì)胞接種于24孔板(每孔10 000)，貼壁后按SA-β-Gal檢測(cè)試劑盒流程操作，顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)，藍(lán)色著色的細(xì)胞即為衰老細(xì)胞，計(jì)算衰老細(xì)胞陽(yáng)性率反映細(xì)胞衰老水平。

2.7Western blotRIPA buffer提取蛋白，20 μg總蛋白經(jīng)SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，雜交袋中I抗4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記II抗37℃孵育2 h，按照ECL說(shuō)明書(shū)顯影曝光，ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，tBHQ干預(yù)組與DMSO溶劑對(duì)照組均數(shù)比較用兩配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 tBHQ對(duì)晚期BMSCs蛋白酶體活性的影響

tBHQ 30 μmol/L持續(xù)作用于傳代晚期的BMSCs 4周，化學(xué)發(fā)光法測(cè)量蛋白酶體活性結(jié)果顯示，tBHQ組蛋白酶體活性上調(diào)21.96%±1.96%，與tBHQ溶劑對(duì)照組(DMSO組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示tBHQ能夠上調(diào)體外培養(yǎng)晚期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白酶體活性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of tBHQ on proteasome activity of the latestage BMSCs.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs DMSO.圖1 tBHQ對(duì)傳代晚期BMSCs蛋白酶體活性的影響

2 tBHQ對(duì)傳代晚期BMSCs細(xì)胞活力、增殖潛能及細(xì)胞周期分布的影響

2.1tBHQ對(duì)晚期BMSCs細(xì)胞活力的影響及其劑量依賴性CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著tBHQ作用濃度增加(5 μmol/L～40 μmol/L)，細(xì)胞活力和增殖能力逐漸增強(qiáng)，至40 μmol/L到達(dá)平臺(tái)期并維持在較高水平。tBHQ濃度升高至120 μmol/L，仍未見(jiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

2.2tBHQ對(duì)晚期BMSCs增殖能力的影響B(tài)rdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，其BrdU陽(yáng)性率較DMSO溶劑對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)。提示tBHQ可以增強(qiáng)晚期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，見(jiàn)圖3。

2.3tBHQ對(duì)晚期BMSCs細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，可見(jiàn)tBHQ組G0/G1期細(xì)胞較DMSO組減少，但S期和G2/M期細(xì)胞增多，細(xì)胞增殖指數(shù)較DMSO組顯著提高9.93%±1.61% (P＜0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 2.The CCK-8 assay indicated that tBHQ promoted the late-stage BMSCs viability in a concentration-dependent manner.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs DMSO.圖2 tBHQ對(duì)晚期BMSCs細(xì)胞活力的影響具有劑量依賴性

Figure 3.The effect of tBHQ on the proliferation of late-stage BMSCs by BrdU incorporation.Mean±SEM.n=15.*P＜0.05 vs DMSO.圖3 BrdU摻入法檢測(cè)tBHQ對(duì)傳代晚期hBMSCs增殖能力的影響

表1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)晚期BMSCs細(xì)胞周期分布Table 1.Cell cycle distribution of late stage BMSCs tested by flow cytometry (%.Mean±SEM.n=3)

3 tBHQ對(duì)傳代晚期BMSCs衰老表型的影響

3.1tBHQ對(duì)晚期BMSCs衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性的影響SA-β-Gal染色結(jié)果顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，其SA-β-Gal陽(yáng)性率較DMSO溶劑對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effect of tBHQ on SA-β-Gal activity of the late-stage BMSCs.Mean±SEM.n=8.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖4 tBHQ對(duì)晚期BMSCs衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性的影響

3.2tBHQ對(duì)晚期BMSCs衰老相關(guān)蛋白P53表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，tBHQ作用于晚期BMSCs，衰老相關(guān)蛋白P53的表達(dá)水平下降78.20%±8.18%，與DMSO溶劑對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effect of tBHQ on P53 expression in late-stage BMSCs.Mean±SEM.n=4.*P＜0.05 vs DMSO.圖5 tBHQ對(duì)晚期BMSCs P53表達(dá)的影響

討論

干細(xì)胞具有修復(fù)受損組織、器官，重塑機(jī)體生物學(xué)功能的作用，因而在移植應(yīng)用中具有廣泛的前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，具有多向分化潛能，同時(shí)具有低免疫原性，易分離培養(yǎng)、擴(kuò)增純化，便于自體移植等優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞治療和組織工程中理想的種子細(xì)胞，但其細(xì)胞數(shù)量的不足以及體外擴(kuò)增中出現(xiàn)的復(fù)制性衰老及其伴隨的干性下降是限制其臨床應(yīng)用的瓶頸［10-11］，因而尋找有效的方法和靶點(diǎn)延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的復(fù)制性衰老進(jìn)程是提高干細(xì)胞移植治療療效的關(guān)鍵，并可為其更廣泛而有效的臨床應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

已有研究顯示，干細(xì)胞的復(fù)制性衰老可能與其在體外擴(kuò)增過(guò)程中基因穩(wěn)定性降低，端粒酶變短，氧化應(yīng)激水平增高等多種因素有關(guān)，調(diào)節(jié)相應(yīng)的ERK、MAPK、Akt等信號(hào)通路可以延緩干細(xì)胞復(fù)制性衰老進(jìn)程［9，12-16］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，蛋白酶體功能障礙與BMSCs的復(fù)制性衰老過(guò)程密切相關(guān)，通過(guò)藥物或轉(zhuǎn)基因的方式提高蛋白酶體的表達(dá)量及其活性可能是延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)制性衰老的可能途徑［5-6］。因而本文擬尋找提高蛋白酶體活性，同時(shí)又是比較安全的方式來(lái)達(dá)到延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)制性衰老。

tBHQ是一種人工合成的酚類強(qiáng)抗氧化劑，常作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于油脂食品中以阻止食物油脂氧化變質(zhì)。已有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用tBHQ能夠通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)干細(xì)胞死亡，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞具有保護(hù)作用［8］;而Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活可以參與泛素-蛋白酶體通路的調(diào)節(jié)，促進(jìn)蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體功能活性從而恢復(fù)成纖維細(xì)胞增殖活力［7］。我們將tBHQ作用于傳代晚期的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示其可以通過(guò)提高蛋白酶體活性，進(jìn)而提高細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活力;減少衰老細(xì)胞陽(yáng)性率，降低P53蛋白的表達(dá)量。關(guān)于P53蛋白的表達(dá)，我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［17］顯示傳代晚期BMSCs的P53表達(dá)水平較早期組顯著增加，是復(fù)制性衰老的主要表型之一?？梢?jiàn)tBHQ可以作用于體外培養(yǎng)傳代晚期已出現(xiàn)復(fù)制性衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)提高干細(xì)胞蛋白酶體活性，逆轉(zhuǎn)或延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)制性衰老進(jìn)程。這與Arlt等［9］在腫瘤細(xì)胞中觀察到的應(yīng)用tBHQ可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，提高蛋白酶體活性，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、提高其耐藥性的研究結(jié)果一致。可見(jiàn)在多種不同類型的細(xì)胞中，tBHQ都具有細(xì)胞保護(hù)作用。同時(shí)我們觀察到大劑量tBHQ干預(yù)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，而其又是一種常用的食品添加劑，提示tBHQ可以作為一種比較安全的干預(yù)手段，延緩因蛋白酶體功能障礙引起的晚期BMSCs復(fù)制性衰老進(jìn)程，從而為細(xì)胞移植治療和組織工程提供數(shù)量充足的種子細(xì)胞。

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(責(zé)任編輯:盧萍，余小慧)

tBHQ delayed replicative senescence by activating the proteasome system of BMSCs

SONG Hui-fang，YANG Jia-chao，NIU Xiao-jie，LU Li
(Department of Anatomy，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.E-mail: luli7300@126.com )

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of tert-butylhydroquinone (tBHQ) on the replicative senescence of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).METHODS: Late stage BMSCs were continuously treated with tBHQ at concentration of 30 μmol/L for 4 weeks and the cells were used for the following assays immediately.The proteasomal activity was determined by chemiluminescence method.The samples were subjected to CCK-8 assay and BrdU incorporation as well as flow cytometry analysis for analyzing the cell vitality and proliferation.Percentage of senescent cells was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining.The expression of P53 was measured by Western blot.RESULTS: After the continuous treatment of tBHQ (30 μmol/L) for 4 weeks，the proteasomal activity of late stage BMSCs increased by 21.96%±1.98% (P＜0.05).The cell vitality and survival were significantly increased with the increases in tBHQ doses till 40 μmol/L，and no cytotoxicity reaction with the increased dose of tBHQ till 120 μmol/L was observed.BrdU-positive cells，which represented the cell proliferation，were significantly increased (P＜0.05).The proliferation index was also significantly increased by flow cytometry analysis (P＜0.05).The SA-β-Gal positive cells and the expression of P53 were decreased (P＜0.05).CONCLUSION: tBHQ delays the proteasome dysfunction associated senescence progress of BMSCs by increasing the proteasomal activity.

［KEY WORDS］Tert-butylhydroquinone; Bone marrow mesenchymal stem cells; Replicative senescence

通訊作者△Tel: 0351-4135787; E-mail: luli7300@126.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81200254) ;山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.2014-033)

［收稿日期］2015-02-09

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1647-05

［中圖分類號(hào)］R339.3+8; R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.021