玄龍止咳顆粒中有效成分含量測定

曹 蕾,楊紅梅,單麗芳,宋 英

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

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玄龍止咳顆粒中有效成分含量測定

曹 蕾1,楊紅梅1,單麗芳1,宋 英2*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：建立HPLC法測定玄龍止咳顆粒中鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿、哈巴俄苷含量的方法。方法：鹽酸麻黃堿、鹽酸麻黃堿的色譜條件為:Wondasil-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相甲醇-0.1%的磷酸(含0.1%的三乙胺)(4∶96)，流速1.0mL·min-1，溫度30℃，進(jìn)樣量10μL，檢測波長210nm；哈巴俄苷的色譜條件為： Kromasil100-5-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為0.03%的磷酸(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～10min，90%～97%A；10～20min，67%～90% A；20～25min，50%～67% A；25～30min,20%～50% A，30～35min，20% A；35～37min，20%～97% A)，柱溫35℃，檢測波長280nm，流速1.0mL·min-1，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、哈巴俄苷線性范圍分別為0.164 4～1.644 0μg(r=1.0)，0.183 6～1.813 6μg(r=0.999 9)，0.204 8～2.048 0(r=0.999 9) ，平均加樣回收率分別為100.56%(RSD=1.48%)，100.58%(RSD=0.63%)，99.83%(RSD=2.35%)。結(jié)論：建立的測定方法精密度高、重復(fù)性好，可用于玄龍止咳顆粒劑的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了基礎(chǔ)。

玄龍止咳顆粒；鹽酸麻黃堿；鹽酸偽麻黃堿；哈巴俄苷；含量

玄龍止咳為成都中醫(yī)藥大學(xué)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由玄參、蜜麻黃、地龍、僵蠶等藥味組成，全方滋陰宣肺，祛風(fēng)止咳，治療中最具特色之處是內(nèi)外風(fēng)兼治，滋陰祛風(fēng)兼顧，療效顯著。方中玄參為君藥，具有清肺、解毒消火功效最宜于肺結(jié)核、肺熱咳嗽，哈巴俄苷為玄參中含量較高的成分,文獻(xiàn)報(bào)道具有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛、解痙、抗乙肝病毒以及免疫促進(jìn)作用[1]；蜜麻黃為臣藥，增潤肺之功，適宜于肺燥失宣所致的咳嗽，麻黃堿，偽麻黃堿是主要有效成分[2]，故將三者納入檢測指標(biāo)。本文中建立的方法，通過方法學(xué)驗(yàn)證，操作簡便，重復(fù)性好，為玄龍止咳顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國惠普公司) 、BP211D型電子分析天平(德國塞多利公司)；鹽酸麻黃堿(批號:171241-201007)、鹽酸偽麻黃堿(批號:171237-201208)、哈巴俄苷(批號:111730-201307)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；玄龍止咳顆粒為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院本課題所研制(批號分別為：20150511、20150515、20150520)。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃含量測定

2.1.1 色譜條件[3-5]Wondasil-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：以0.1%的磷酸(含0.1%的三乙胺)為流動相A，甲醇為流動相C；柱溫30℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣體積：10μL，檢測波長210nm。

2.1.2 溶液制備 對照品溶液的制備：分別精密稱定鹽酸麻黃堿4.11mg、鹽酸偽麻黃堿4.59mg于25mL的容量瓶中，加甲醇定容到刻度制成質(zhì)量濃度為0.164 4mg·mL-1、0.183 6mg·mL-1的混合溶液，作為對照品，備用。供試品溶液的制備：本品顆粒1g，研細(xì)，置于10mL錐形中，加入10mL0.1%鹽酸甲醇精密稱定，超聲處理1h，加0.1%鹽酸甲醇補(bǔ)足重量，搖勻。用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.1.3 專屬性考察 按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，并且各組分互不干擾，陰性對照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，本方法專屬性良好。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別吸取2.1.2項(xiàng)下對照品溶液，1、2、3、2、10mL分別于10、10、10、5、10mL容量瓶中，分別標(biāo)號1、2、3、4、5號對照品，用甲醇稀釋至刻度，超聲后過濾，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣。以進(jìn)樣量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。鹽酸麻黃堿回歸方程為：Y=28 078X+12.796(r=1.0)、鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為：Y=28 295X-5.616(r=0.999 9)。結(jié)果表明：鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿分別在0.164 4～1.644 0μg、0.183 6～1.813 6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.4”項(xiàng)下2號對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖，測定每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿的RSD值分別為0.020%、0.094%，表明精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玄龍止咳顆粒(批號：20150511 )2g， 共6份，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿的平均含量為0.483 5mg·g-1，鹽酸偽麻黃堿的平均含量為1.167 6mg·g-1；其含量的RSD值分別為1.32%、1.44%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液(批號：20140511 )，取同一樣品溶液，分別于第0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣進(jìn)行測定，結(jié)果鹽酸偽麻黃堿、鹽酸麻黃堿的RSD值分別為1.29%、1.57%，結(jié)果表明本品在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號：20150511，鹽酸麻黃堿的含量為0.483 5mg·g-1，鹽酸偽麻黃堿的含量為1.167 6mg·g-1)1g，共6份，研細(xì)，精密加入混合對照品(鹽酸麻黃堿0.164 4mg·mL-1、鹽酸偽麻黃堿0.183 6mg·mL-1)4mL，按供試品溶液方法制備，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.2 玄參含量測定

2.2.1 色譜條件[6-8]Kromasil100-5-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：以0.03%的磷酸為流動相A，乙腈為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫；柱溫35℃；進(jìn)樣體積：10μL。按表2進(jìn)行梯度洗脫。

2.2.2 溶液制備 對照品溶液的制備：精密稱定哈巴俄苷2.50mg于25mL的容量瓶中，加甲醇定容到刻度制成質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的混合溶液，作為對照品，備用。供試品溶液的制備：取本品顆粒1g，研細(xì)，置于10mL容量瓶中，加入10mL50%甲醇進(jìn)行超聲處理1h，加50%甲醇至刻度，搖勻。用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

表1 鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 梯度洗脫程序 (%)

2.2.3 專屬性考察 按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別精密吸取哈巴俄苷對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各10μL進(jìn)樣分析，記錄色譜,見圖2。哈巴俄苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，并且各組分互不干擾，陰性對照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，本方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，1、2、3、2、10mL分別于10、10、10、5、10mL容量瓶中，分別標(biāo)號1、2、3、4、5號對照品，用甲醇稀釋至刻度，超聲后過濾，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。以進(jìn)樣量(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。哈巴俄苷回歸方程為：Y=24 024X+1.718 1(r=0.999 9) 。結(jié)果表明：哈巴俄苷在0.204 8～2.402 8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 哈巴俄苷與玄參樣品色譜

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖，測定每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果哈巴俄苷的RSD值為0.10%，表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批玄龍止咳顆粒劑(批號：20150511 )1g， 共6份，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果樣品中哈巴俄苷的平均含量為0.3170 mg·g-1，其含量的RSD值為2.11%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液(批號：20140511 )，取同一樣品溶液，分別于第0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣進(jìn)行測定，哈巴俄苷的RSD值分別為0.664%，結(jié)果表明本品在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號：20150511，哈巴俄苷的的含量為0.3170 mg·g-1)1g，共6份，精密加入哈巴俄苷對照品溶液(0.1 mg·mL-1)3mL，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 哈巴俄苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：哈巴俄苷的平均回收率為99.83%，RSD值為2.35%；表明該方法的加樣回收率較好，該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.3 樣品測定

取3批玄龍止咳顆粒樣品，每批3份，精密稱取樣品2g，按麻黃和玄參供試品溶液的制備方法制備。分別精密吸取各自的對照品溶液和樣品溶液各10μL，按各自色譜條件分別測定，計(jì)算3批樣品中鹽酸麻黃堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.483 5、0.475 7、0.491 2mg·g-1，RSD為1.60%；鹽酸偽麻黃堿為1.167 6、1.160 9、1.169 5mg·g-1，RSD為0.39%；哈巴俄苷為0.317 0、0.319 8、0.314 3mg·g-1，RSD為0.87%，表明該方法適合玄龍止咳顆粒中有效成分的含量測定。

3 討論

麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿均為苯丙胺類生物堿，采用的對照品是鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，故在考察稀釋劑時(shí)，除了考察常規(guī)的甲醇、乙腈以及藥典中記載的1.44%的磷酸之外，還考察了1%的鹽酸甲醇。對比前三者，使用鹽酸甲醇的峰形更好，而且測出來的含量要偏高一些，有可能是1%的鹽酸甲醇使得鹽酸麻黃堿和偽麻黃堿更好的游離而易于被檢測到。

玄參中主要指標(biāo)性成分，除了哈巴俄苷之外還有哈巴苷。試驗(yàn)中也試圖考察哈巴苷的含量，但是在玄參陰性圖譜中，哈巴苷的位置有干擾，故僅將哈巴俄苷納入指標(biāo)。

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(責(zé)任編輯：余 婷)

Determination of Effective Components in the XuanLong Cough Granule

Cao Lei1,Yang Hongmei1,Shan Lifang1,Song Yng2*

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine(TCM) ,Chengdu 610075,China; 2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To establish an HPLC method for determining ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride,harpagosides in XuanLong cough granule.Methods:HPLC conditions of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride were as follows :C18column (250mm×4.6mm，5μm),mobile phase was methanol-0.1% phosphate (including 0.1% of triethylamine) (4∶96),flow rate 1.0mL·min-1,column temperature 30 ℃,injection volume 10μL,detection wavelength 210nm;and conditions of harpagosides were:Kromasil 100-5-C18column (250mm×4.6mm,5μm),the mobile phase was 0.03% phosphate (A)-acetonitrile (B) with gradient elution program (0～10min,97～90%A;10～20min,90～67%A; 20～25min,67～50%A;25～30min,50～20%A,30～35min,20%A; 35～37min,20～97%A),column temperature 35℃,detection wavelength 280nm,flow rate 1.0mL·min-1,injection volume 10μL.Results:linear ranges of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride,harpagosides were 0.164 4～1.644μg (r=1.0),0.183 6～1.813 6μg (r=0.999 9), 0.204 8～2.048μg(r=0.999 9) ,the average recoveries of them were 100.56% (RSD=1.48%),100.58 (RSD=0.63%),99.83 (RSD=2.35%).Conclusion:the established determination method was high precision and good reproducible,which can be used in the quality control of XuanLong cough granules,and laid the foundation to establish its quality standard.

XuanLong Cough Granules; Ephedrine Hydrochloride; Pseudoephedrine Hydrochloride;Harpagosides；Content

2015-07-21

四川省科技廳項(xiàng)目(CKY2014007)

曹蕾(1989-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿?/p>

宋英(1959-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail：806380106@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)23-0031-04

10.11954/ytctyy.201523012