豬α干擾素基因突變、表達(dá)及其高效抗病毒活性篩選研究

李 爽張 杏崔 栩劉海燕蘇敬良金忠輝?

（1.北京偉嘉集團(tuán)創(chuàng)新研究院，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

豬α干擾素基因突變、表達(dá)及其高效抗病毒活性篩選研究

李 爽1，2，張 杏1，崔 栩1，劉海燕1，蘇敬良2，金忠輝1，2?

（1.北京偉嘉集團(tuán)創(chuàng)新研究院，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

利用RT－PCR方法從豬肝細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出編碼豬α干擾素基因，根據(jù)大腸桿菌偏嗜性及活性位點(diǎn)改造基因并克隆至原核表達(dá)載體pET21a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定。重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)變－復(fù)性及純化處理后，獲得多種不同基因型的高純度豬α干擾素。用細(xì)胞病變抑制法在MDBK／VSV系統(tǒng)上進(jìn)行抗病毒活性測(cè)定，結(jié)果表明經(jīng)過基因改造的豬α干擾素（PoIFN－M6）具有更高抗病毒活性，約為2.97×108U／mg。本研究為豬α干擾素基因工程產(chǎn)品的研發(fā)及其在臨床獸醫(yī)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

豬α干擾素；表達(dá)；基因型；抗病毒活性

隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)從傳統(tǒng)養(yǎng)殖向規(guī)?；⒓s化模式地迅速發(fā)展，疾病的威脅也隨之增加，尤其是豬病毒性疾病嚴(yán)重制約著行業(yè)的持續(xù)發(fā)展。干擾素（Interferon，IFN）是動(dòng)物機(jī)體第一抵御病毒體系，具有廣譜抗病毒活性，可以有效的抑制RNA病毒及DNA病毒的復(fù)制［1－3］。因此，發(fā)展有廣譜抗病毒效應(yīng)的豬干擾素具有重要的意義。

近年來，基因工程技術(shù)發(fā)展快速，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用不同的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)干擾素進(jìn)行表達(dá)［4－6］，然而干擾素的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)、理化特性、生物學(xué)特性、產(chǎn)生和作用機(jī)理等仍需進(jìn)一步研究。國(guó)內(nèi)學(xué)者曹瑞兵等［7］發(fā)現(xiàn)IFN基因中含有較多的大腸桿菌稀有密碼子，并對(duì)其進(jìn)行基因改造獲得干擾素抗病毒活性為6.4×106U／mg。陳濤等［8］用定點(diǎn)突變方法把豬α干擾素第86位半胱氨酸（Cys）突變?yōu)槔野彼幔═yr），獲得蛋白活性為5.2×103IU／mg。Li等［9］根據(jù)不同亞型干擾素基因合成保守豬α干擾素序列（consensus porcine interferon，CoPoIFN－α），抗病毒活性提高約10倍。研究從豬肝臟中克隆獲得豬α干擾素基因，根據(jù)大腸桿菌偏嗜性及活性位點(diǎn)改造基因，然后利用大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬α干擾素融合蛋白，目的產(chǎn)物較原始序列對(duì)應(yīng)的蛋白具有更高的抗病毒活性。本研究為豬α干擾素基因工程產(chǎn)品的研發(fā)及其在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種和質(zhì)粒：感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，質(zhì)粒pET21a為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院蘇敬良博士惠贈(zèng)；工具酶和試劑：Phusion高保真DNA聚合酶、內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；Trizol及Su?perscript III反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen；一步法快速WB（HRP）試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，小鼠抗豬α干擾素抗體（ab11408）購自美國(guó)Abcam公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；牛腎細(xì)胞（MDBK）及水皰性口炎病毒（VSV）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬肝臟總RNA提取與豬α干擾素基因克隆

用Trizol試劑法提取豬肝臟總RNA，以總RNA為模板，用SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù) GenBank公布的豬 α干擾素序列（No.KF414740.1），設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（1F：ATGGCCCCAA CCTCAGCCTTCCT； 1R： TCACTCCTTCTTCCT?GAGTCTGTC），以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，所得產(chǎn)物即為豬α干擾素，命名為PoIFN－α。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.2.2 豬α干擾素序列分析及定點(diǎn)突變 將獲得的豬α干擾素序列與GenBank公布的序列進(jìn)行對(duì)比。根據(jù)大腸桿菌偏嗜性，將稀有密碼子進(jìn)行改造并交于公司重新合成，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變（表1）。利用overlap PCR方法設(shè)計(jì)突變引物，以PoIFN－α為模板對(duì)第38、78、152、156位氨基酸進(jìn)行突變獲得 PoIFN－M1、PoIFN－M2及PoIFN－M3。在之前突變序列的基礎(chǔ)上對(duì)第86位氨基酸進(jìn)行突變，獲得PoIFN－M4、PoIFN－M5及PoIFN－M6。

表1 豬α干擾素突變位點(diǎn)

1.2.3 重組豬α干擾素原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)pET21a多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)帶有BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)引物（BF：CGCGGATCCTGCGACCTGCCT?CAGAC；XR： CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCT?GAG），以突變的不用基因型干擾素基因?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠分離回收擴(kuò)增產(chǎn)物。分別用BamHI、XhoI對(duì)pET21a和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后，16℃進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），菌落PCR篩選陽性克隆并測(cè)序，測(cè)序正確后進(jìn)行表達(dá)。

1.2.4 重組豬α干擾素原核表達(dá)及包涵體提取挑選陽性克隆菌株接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以10%接種擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD600＝0.6時(shí)，加入IPTG（0.5 mmol／L）于37℃誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)5 h后收集菌體，超聲波裂解、離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)形式。超聲波破碎后，離心沉淀用適量包涵體洗滌液（50 mmol／L Tris－HCl；10 mmol／L EDTA；0.5% Triton X－100；0.15 mol／L NaCl）洗滌2次，再次離心得到初步純化的包涵體。

1.2.5 重組豬α干擾素原核包涵體變性及復(fù)性將獲得包涵體加入 9倍體積的包涵體裂解液（50 mmol／L Tris－HCl；2 mmol／L EDTA；6 mol／L鹽酸胍；10 mmol／L DTT），劇烈震蕩后4℃過夜直至完全溶解，離心上清液即為變性后蛋白。將變性蛋白過加入已平衡的Ni－Agarose，用500 mmol／L咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫液，加入包涵體復(fù)性液（50 mmol／L Tris－HCl；0.2 mmol／L EDTA；0.5 MLArg；1 mmol／L GSSG；3 mmol／L GSH；1mol／L鹽酸胍；0.15 mol／L NaCl）中，4℃靜置4 h，離心取上清即為復(fù)性的重組蛋白。將溶液放入透析袋中，4℃條件下用0.01 mol／L PBS（pH 7.2）透析72 h，無菌過濾后測(cè)定蛋白含量及抗病毒活性。

1.2.6 Western－bolt鑒定 將獲得的重組蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，然后用含5%BSA的PBST封閉過夜，以小鼠抗豬α干擾素抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗，顯色試劑盒顯色。

1.2.7 重組豬α干擾素原核的活性測(cè)定 微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組豬α干擾素生物學(xué)活性，采用MDBK－VSV系統(tǒng)測(cè)定。將抑制50%細(xì)胞病變（CPE50）的干擾素的最高稀釋度定為1個(gè)干擾素單位（U）。

2 結(jié)果

2.1 豬α干擾素基因克隆及定點(diǎn)突變 以提取的新鮮豬肝細(xì)胞總RNA為模板，RT－PCR產(chǎn)物電泳后可見一條570 bp大小的條帶，與預(yù)期一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，克隆產(chǎn)物大小為 570 bp，與GenBank上發(fā)表的豬α干擾素基因同源性為100%（No.EU127823.1）。基因組含有一個(gè)ORF，共編碼189個(gè)氨基酸。其中前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，后166個(gè)氨基酸為 IFN－α成熟序列。利用 overlap PCR方法獲得設(shè)計(jì)引物并對(duì)24－189位氨基酸進(jìn)行蛋白表達(dá)。

圖1 豬α干擾素基因擴(kuò)增

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用BamHI和XhoI雙酶切pET21a及獲得的突變基因PCR產(chǎn)物，16℃連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3）中，挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，BamHI和XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)一致（圖2）。

圖2 pET－PoIFN－a的雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達(dá) 取誘導(dǎo)菌體，用加樣緩沖液煮沸10 min后作SDS－PAGE鑒定。在電泳圖譜上出現(xiàn)一條約19 kD的目的條帶（圖3），經(jīng)過灰度分析軟件Image J分析表明，目的蛋白約占細(xì)菌總蛋白的17%。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，分別取超聲破菌的上清液和離心后的沉淀作SDS－PAGE分析，結(jié)果顯示表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。

圖3 豬α干擾素在重組菌株中的表達(dá)

2.4 包涵體的變性、復(fù)性與純化 包涵體用含Triton X－100的洗滌液洗滌，得到初步純化的包涵體。包涵體在含6 mol／L鹽酸胍的變性液中溶解至澄清，經(jīng) Ni－Agarose純化后的變性蛋白在含1 mol／L鹽酸胍的復(fù)性液中復(fù)性，復(fù)性后重組蛋白進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果表明復(fù)性的重組豬α干擾素純度高于95%（圖4）。

圖4 重組豬α干擾素純化

2.5 Wester－bolt鑒定 重組豬α干擾素經(jīng)轉(zhuǎn)印，將蛋白區(qū)帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用小鼠抗豬α干擾素抗體和HRP標(biāo)記抗體與之反應(yīng)、顯色，結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約為19 kD處出現(xiàn)清晰的區(qū)帶（圖5）。

圖5 豬α干擾素的Western－blot檢測(cè)

2.6 重組豬α干擾素活性的測(cè)定 重組豬α干擾素的活性測(cè)定采用目前國(guó)內(nèi)外通用的MDBK／VSV系統(tǒng)微量細(xì)胞病變抑制法。多次活性檢測(cè)結(jié)果表明，復(fù)性后的重組蛋白在MDBK細(xì)胞上表現(xiàn)出較高的抗病毒活性，能夠有效地抑制VSV病毒。將抑制50%細(xì)胞病變（CPE）的干擾素的最高稀釋度定為1個(gè)干擾素單位。檢測(cè)結(jié)果顯示（表2），經(jīng)過基因改造的干擾素蛋白活性較原始序列對(duì)應(yīng)的蛋白具有更高的抗病毒活性，第86位氨基酸的突變能明顯提高重組干擾素蛋白活性，其中PoIFN－M6活性最高，約為2.97×108U／mg。

表2 重組干擾素蛋白抗病毒活性測(cè)定

3 討論

本研究應(yīng)用PCR技術(shù)從豬肝細(xì)胞基因組中克隆出豬α干擾素基因，測(cè)序結(jié)果表明本研究克隆的的豬α干擾素基因與GenBank上發(fā)表的豬α干擾素基因同源性為100%，全基因?yàn)?70 bp，編碼166個(gè)氨基酸的成熟蛋白和23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。豬α干擾素?zé)o內(nèi)含子，無糖基化位點(diǎn)。在氨基酸水平上，豬 α干擾素與人類 α干擾素的同源性為77.8%，而與豬β干擾素及豬γ干擾素的同源性為53.1%和41.7%。

根據(jù)大腸桿菌偏嗜性及文獻(xiàn)報(bào)道的增強(qiáng)抗病毒活性位點(diǎn)［8－9］，對(duì)克隆的豬 α干擾素進(jìn)行突變，以增加其表達(dá)量及提高抗病毒活性。改造的重組豬α干擾素連接至帶有His標(biāo)簽的pET21a，pET系統(tǒng)在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中具有較大的優(yōu)點(diǎn)，pET質(zhì)粒的T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制的T7 RNA聚合酶機(jī)制，能充分誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。構(gòu)建工程菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組豬α干擾素約占細(xì)菌總蛋白的17%。通過軟件分析重組豬α干擾素具有較強(qiáng)的疏水性，本研究重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，包涵體可以通過洗滌、離心方法將其迅速純化，但包涵體蛋白需經(jīng)過變復(fù)性處理才能得到有生物活性的蛋白。Hagihara等［10］發(fā)現(xiàn)高濃度鹽酸胍可使天然蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞而低濃度的鹽酸胍能夠保護(hù)伸展肽鏈和部分折疊片段的疏水基團(tuán)，可輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。本研究在復(fù)性液中加入終濃度為1 mmol／L的鹽酸胍可較好提高重組蛋白在復(fù)性液中的溶解度并促進(jìn)其復(fù)性。

試驗(yàn)通過對(duì)豬α干擾素序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得不同基因型重組蛋白，抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過基因改造的干擾素蛋白活性較原始基因抗病毒活性增高，第86位氨基酸的突變能明顯提高重組干擾素蛋白活性。成熟PoIFN－α基因存在5個(gè)半胱氨酸，其中在1、99和29、139位之間形成2個(gè)二硫鍵，有研究發(fā)現(xiàn)存在的二硫鍵對(duì)干擾素活性具有重要影響［11］。Wang等［12］報(bào)道將IFN的第86位Cys突變?yōu)锳sp，生物學(xué)活性有明顯提高。另外陳濤等［8］也發(fā)現(xiàn)突變86位Cys能提高干擾素活性。推測(cè)可能在包涵體表達(dá)情況下，重組蛋白復(fù)性過程中86位Cys錯(cuò)配影響正常二硫鍵結(jié)構(gòu)從而降低干擾素活性。Li［9，13］通過同源建模發(fā)現(xiàn)其中38、78位氨基酸分別位于IFN helixB及Loop CD結(jié)構(gòu)，38、151位氨基酸相鄰并且它們所在的肽鏈均指向結(jié)構(gòu)核，156位氨基酸與IFNAR2受體結(jié)合部位較近，突變后可能影響IFN與IFNAR2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)，從而改變干擾素生物活性活性，對(duì)干擾素基因序列研究還需要進(jìn)一步深入研究。

試驗(yàn)通過對(duì)豬干擾素基因進(jìn)行突變改造，篩選較高生物活性的重組蛋白，為進(jìn)一步研究和利用基因工程豬α干擾素奠定基礎(chǔ)。

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（編 輯：陳 希）

The Mutations，Expression and Antiviral Activity Screening of Porcine Interferon－α

LI Shuang1，2，ZHANG Xing1，CUI Xu1，LIU Hai－yan1，SU Jing－liang2，JIN Zhong－h(huán)ui1，2?
（1.Innovation Research Institute，Beijing Vica Group，Beijing100085，China；2.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

The aim of this study is to obtain porcine interferon－α with high antiviral activity.Total RNA extracted from swine liver was used for the generation of the porcine interferon－α cDNA.Here we optimized the codon usage of the gene forE.coli.Then the reconstructed fragments were cloned into vector pET21a to obtain the different genotypes of interferon－α，and expressed inE.coliBL21（DE3）.The results showed that the protein was expressed as inclusion body.After dissolution，re－naturation and purification，we gained the pure protein.The effect of the reconstructed porcine interferon－α on reduction of viral cytopathic effect（CPE）was detected in MDBK cells infected with vesicular stomatitis virus（VSV）.As a result，the protein PoIFN－M6 was verified to have a high antivital activity by CPE inhibition test，which was about 2.97×108U／mg.The research laid the foundation for the genetic expression of porcine interferon－α and the clinical use of it.

porcine interferon－α；expression；genotype；antiviral activity

2014－12－25

A

1002－1280（2015）04－0012－05

S859.79

李 爽，博士后，從事動(dòng)物疾病診斷方面研究。

金忠輝。E－mail：jzh＠vicagroup.com.cn