阿莫西林混懸注射液在豬體內(nèi)的生物等效性研究

潘 娟，嚴(yán) 鳳，顧 欣

（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

阿莫西林混懸注射液在豬體內(nèi)的生物等效性研究

潘 娟，嚴(yán) 鳳，顧 欣

（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

為了研究阿莫西林混懸注射液在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性，采用雙處理、雙周期隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將24頭健康豬隨機(jī)分成2組，按15 mg／kg體重肌肉分別單劑量注射受試制劑和參比制劑，采用高效液相色譜法測定血漿中阿莫西林的濃度，利用WinNonlin6.4軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并評價(jià)兩種制劑的生物等效性。結(jié)果顯示，受試制劑和參比制劑的Tmax分別為（3.45±2.49）h，（1.34±1.74）h；Cmax分別為（6.94±4.73）mg／L，（4.39±2.87）mg／L；AUC0－t分別為（37.00±11.48）mg·h·L－1，（30.02±8.93）mg·h·L－1；AUC0－∞分別為（40.26±13.36）mg·h·L－1，（38.46±15.38）mg·h·L－1。阿莫西林混懸注射液受試制劑和參比制劑的AUC0－t、AUC0－∞、Cmax、Tmax均有顯著性差異，雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種制劑生物不等效，試驗(yàn)為獸醫(yī)臨床給藥方案的制定以及合理用藥提供參考。

阿莫西林混懸注射液；高效液相色譜法；藥代動(dòng)力學(xué)；生物等效性

阿莫西林（Amoxicillin，AMO）又稱羥氨芐青霉素，是半合成廣譜青霉素類抗生素，其性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸，在胃酸中穩(wěn)定、吸收迅速、分布廣泛，同時(shí)又具有殺菌作用較強(qiáng)、副作用較少、劑型多樣、與其他藥物聯(lián)用方便和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于獸醫(yī)臨床［1－2］。本試驗(yàn)以豬為研究對象，通過對豬血漿中阿莫西林HPLC測定方法的建立，研究了兩種阿莫西林混懸注射液的生物等效性，為獸醫(yī)臨床合理使用阿莫西林混懸注射液提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 阿莫西林對照品，Dr Ehrenstorfer GmbH，99.5%，批號81023；受試制劑，阿莫西林注射液，A廠，規(guī)格100 mL∶15 g，批號140702；參比制劑，阿莫西林注射液，碩騰（上海）動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格100 mL∶15 g，批號36921101；甲醇，色譜純，Merck公司；去離子水；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀（Waters公司，Acquity UPLC配PDA紫外檢測器）、渦旋混合儀（IKA公司，MS3 basic）、氮?dú)獯蹈桑∣rganomation Associates，Jnc.公司，N－EVAP112）、固相小柱（Waters公司，Oasis HLB，1cc／30mg）、WinNonlin6.4數(shù)據(jù)處理軟件（北京創(chuàng)騰科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)挑選健康杜長大三元雜交豬24頭，90日齡，體重45 kg左右，雌雄各半，上海種豬測定中心，自由飲水，飼喂不含藥物的飼料，每天定時(shí)給料2次。給藥前飼喂1周，適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1 血漿中阿莫西林測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex XB－C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為0.1%鹽酸溶液（A）、甲醇（B），線性梯度洗脫［A－B：0 min（90∶10）→4 min（90∶10）→4.2 min（10∶90）→5 min（10∶90）→5.2 min（90∶10）→7 min（90∶10）］，流速為1 mL／min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長220 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取阿莫西林對照品適量，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得阿莫西林濃度為10 mg／mL的貯備液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取空白血漿400 μL，加入系列濃度對照品溶液10 μL，配成濃度為0.2、0.5、1、5、10和20 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。再分別向各血漿標(biāo)準(zhǔn)液加入600 μL 5%高氯酸溶液，渦旋2 min，24000 r／min離心5 min，上清液備用。HBL小柱依次用2 mL甲醇，2 mL水活化，取上清液全部過柱，用2 mL水淋洗，抽干。用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL 5%甲醇溶液溶解，過0.2 μm有機(jī)膜過濾后，HPLC測定。以對照品濃度C為橫坐標(biāo)，對照品峰面積A為縱坐標(biāo)，用最小二乘法（W＝1／C2）進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 檢測限和定量限 取5個(gè)空白血漿樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法處理，測得基線噪音值，根據(jù)農(nóng)業(yè)部試驗(yàn)規(guī)范要求，按信噪比S／N＝3為檢測限（LOD），S／N＝10為定量限（LOQ）。

2.1.4 專屬性考察 將空白血漿樣品、一定濃度的對照品溶液加入空白血漿制的血漿樣品和給藥后的3 h血漿樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法操作處理后進(jìn)行測定。

2.1.5 精密度和回收率 取空白血漿400 μL，加入阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（0.2、1、20 μg／mL）的血漿樣品，每一濃度6個(gè)樣品并測定，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行測定，以測定值與加入值之比計(jì)算回收率，并計(jì)算批內(nèi)精密度。連續(xù)3 d配制并測定阿莫西林濃度，考察批間精密度。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取空白血漿400 μL，加入阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（0.2、1、20 μg／mL）的血漿樣品，每一濃度6個(gè)樣品，在室溫放置24 h、－20℃凍存1個(gè)月和－20℃反復(fù)凍融3次，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行測定，以考察室溫、冷凍、凍融3種條件下樣品的穩(wěn)定性。

2.2 生物等效性試驗(yàn)

2.2.1 給藥 采用雙處理、兩周期隨機(jī)交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成兩組，每組12頭。第一組第一周期給予受試制劑阿莫西林混懸注射液，第二周期給予參比制劑阿莫西林混懸注射液；第二組第一周期給予參比制劑阿莫西林混懸注射液，第二周期給予受試制劑阿莫西林混懸注射液。動(dòng)物給藥前稱量體重并記錄。根據(jù)阿莫西林混懸注射液的用法與用量要求，確定給藥劑量為15 mg／kg體重，給藥方式為頸部肌肉注射。兩周期間隔10 d。

2.2.2 血樣采集 分別在豬給藥后10、20、30、45 min和1、2、3、4、6、8、10、12、24、30、36 h前腔靜脈采血5 mL，加入含有抗凝劑的肝素鈉玻璃管中，4000 r／min離心10 min，取上層血漿，－20℃保存。

2.2.3 血漿樣品的處理 吸取血漿400 μL，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行測定。

3 結(jié)果

3.1 血漿中阿莫西林測定方法的建立

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 本方法建立的標(biāo)注曲線在0.2～20 μg／mL濃度范圍內(nèi)線性回歸關(guān)系良好，典型標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y＝35300X＋3230，r＝0.999953。

3.1.2 檢測限和定量限 根據(jù)5個(gè)空白樣品的基線噪音值求其平均值，求得血漿中阿莫西林的LOD和LOQ分別為0.06和0.2 μg／mL。

3.1.3 專屬性考察 在所建立的色譜條件下，分別得到空白血漿樣品的圖譜、空白血漿加入對照品溶液后的圖譜以及給藥后 3 h血漿樣品的圖譜（圖1）。由圖1可知，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿莫西林的測定，保留時(shí)間為3.28 min。

圖1 豬血漿樣品中阿莫西林測定的HPLC典型色譜圖

3.1.4 精密度和回收率 結(jié)果表明，所建立的方法回收率穩(wěn)定，方法的精密度良好。符合《獸用化學(xué)藥品生物等效性研究規(guī)范》的要求（表1）。

表1 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）

3.1.5 穩(wěn)定性考察 低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品，在不同條件下的穩(wěn)定性結(jié)果測定偏差均小于15%，阿莫西林血漿樣品穩(wěn)定性良好。

3.2 血藥濃度－時(shí)間曲線與藥代動(dòng)力學(xué) 24頭豬以15 mg／kg體重肌肉注射受試制劑和參比制劑，取受試豬給藥前及給藥后15個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行測定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿莫西林血藥濃度，采用WinNonlin6.4軟件處理血藥濃度并進(jìn)行計(jì)算，得到受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度－時(shí)間曲線（圖2）和動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2）。

圖2 豬肌肉注射15 mg／kg阿莫西林混懸注射液血藥濃度－時(shí)間曲線

表2 豬肌肉注射受試制劑和參比制劑后的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)

3.3 生物等效性評價(jià) 將AUC0－t、AUC0－∞、Cmax進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差分析，然后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)及置信區(qū)間法計(jì)算，受試制劑AUC0－t、AUC0－∞的90%可信區(qū)間為 103.5%～144.5%、84.9%～131.6%，均超出了參比制劑AUC0－t、AUC0－∞的80～125%的范圍；受試制劑Cmax的90%可信區(qū)間為124.7%～199.2%，也超出了參比制劑Cmax的70～143%的范圍，說明兩種制劑不等效；Tmax通過非參數(shù)檢驗(yàn)，制劑間P值小于0.05，說明制劑間Tmax有顯著性差異，Tmax不等效。

4 討論

本研究中部分試驗(yàn)動(dòng)物給藥后出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，可能是混懸液中部分溶解的藥物先在體內(nèi)達(dá)到藥峰，緩釋部分為藥物懸浮顆粒出現(xiàn)了二次釋放。因此，在藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算和生物等效性計(jì)算采用了非房室模型［3］。健康豬肌肉注受試制劑后，達(dá)峰時(shí)間3.45 h，峰濃度6.94 μg／mL，消除半衰期6.49 h，參比制劑的達(dá)峰時(shí)間1.34 h，峰濃度4.39 μg／mL，消除半衰期14.21 h。與參比制劑相比，受試制劑的達(dá)峰時(shí)間晚，峰濃度高，消除較快。但在同等劑量下，受試制劑在受試個(gè)體體內(nèi)的暴露量較參比制劑高，AUC、Cmax均高于參比制劑，說明兩制劑不等效。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)試驗(yàn)結(jié)果與肖希龍［2］、曾振靈［4］報(bào)道結(jié)果有差異，其原因可能與受試動(dòng)物的個(gè)體差異、制劑的生產(chǎn)工藝、溶劑、輔料等因素有關(guān)。

阿莫西林屬時(shí)間依賴性抗菌藥，當(dāng)濃度在最低抑菌濃度（MIC）以上時(shí)發(fā)揮抗菌作用［5］。根據(jù)文獻(xiàn)資料，該血漿濃度在豬體內(nèi)能對金黃葡萄球菌［6］、胸膜肺炎放線桿菌［7］、副豬嗜血桿菌［7］、多殺性巴氏桿菌［5］的生長能起到有效地抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，受試制劑在給藥24 h后，豬血漿中的阿莫西林基本都不能檢出，參比制劑給藥36 h后，豬血漿中尚能檢出阿莫西林，說明受試制劑在豬體內(nèi)的藥效維持時(shí)間較短，一天后已經(jīng)無藥效作用，不能達(dá)到產(chǎn)品規(guī)定的兩天一次給藥的要求，表明受試制劑尚需進(jìn)一步研究。

［1］何 斌，陸 征，陳 杰，等.阿莫西林在肉雞體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（23）：5813－5815.

［2］肖希龍，胡英杰，高翠華，等.阿莫西林注射用混懸液及其在豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，34（3）：299－303.

［3］黃耀凌，徐 倩，胡海燕，等.鹽酸多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)－藥效學(xué)研究［J］.中國獸藥雜志，2014，48（6）：52－57.

［4］曾振靈，何小娟，黃顯會(huì)，等.阿莫西林注射混懸劑的研制及其在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)［C］.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)討論會(huì)，合肥.2006.

［5］張玲玲，江善祥.阿莫西林藥理與毒理研究進(jìn)展［J］.獸藥與飼料添加劑，2009，14（1）：20－22.

［6］楊雨輝，李笑春，韓新疇，等.阿莫西林在豬血清和組織液中對金黃色葡萄球菌的半體內(nèi)藥動(dòng)－藥效同步模型的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（8）：1723－1729.

［7］曹傳家，王春梅.阿莫西林對副豬嗜血桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗(yàn)［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2014，35（6）：9－10.

（編 輯：陳 希）

Bioequivalence of Amoxicillin Suspension Injection in Pigs

PAN Juan，YAN Feng，GU Xin
（Shanghai Institute for Veterinary Drug＆Feeds control，Shanghai201103，China）

To evaluate the pharmacokinetics and bioequivalence of amoxicillin suspension injection in pigs.In a randomized two－way self－crossover study，24 healthy pigs were randomly divided into two groups，and were given respectively a single dose of test or reference preparations by intramuscular injection（15 mg／kg）.Plasma concentrations of amoxicillin were measured by HPLC.The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin6.4 software，and the bioequivalence were evaluated.The main pharmacokinetic parameters of the test and reference preparations were as follows：Tmaxwere（3.45±2.49） h， （1.34±1.74） h；Cmaxwere（6.94±4.73）mg／L，（4.39±2.87）mg／L；AUC0－twere（37.00±11.48）mg·h·L－1，（30.02±8.93）mg·h·L－1；AUC0－∞were（40.26±13.36）mg·h·L－1，（38.46±15.38）mg·h·L－1.The pharmacokinetic parameters（AUC0－t、AUC0－∞，Cmax、Tmax）showed significant difference between test and reference preparations of amoxicillin suspension injections.The test and reference formulations are not bioequivalent after two one－side t－test.This study will provide theoretical basis for making of veterinary clinical dosage regimen and clinical rational administration.

amoxicillin suspension injection；HPLC；pharmacokinetics；bioequivalence

2015－03－09

A

1002－1280（2015）04－0056－04

S859.79

潘 娟，碩士，畜牧師，從事獸藥飼料檢測工作。E－mail：ipanjuan＠163.com