液質(zhì)聯(lián)用法測定豬肝中β－受體激動劑殘留的不確定度評定

黃雪英，齊 敏，沈 丹，鐘錦輝，胡麥玲，譚 諾

（廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣州510440）

液質(zhì)聯(lián)用法測定豬肝中β－受體激動劑殘留的不確定度評定

黃雪英，齊 敏，沈 丹，鐘錦輝，胡麥玲，譚 諾

（廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣州510440）

采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS）測定豬肝中9種β－受體激動劑殘留量，對標準溶液、標準曲線、樣品稱量、稱量重復性、定容體積等因素進行分析，通過評定各不確定度分量及標準不確定度，得出9種β－受體激動劑的合成相對標準不確定度為5.60%～8.90%，影響較大的因素為標準曲線和測量重復性。

不確定度；β－受體激動劑；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜

β－受體激動劑可促進動物生長、抑制脂肪合成，提高瘦肉率，被用于飼養(yǎng)動物后，易在動物組織中殘留，從而影響消費者身體健康。農(nóng)業(yè)部明令禁止克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、氯丙那林等16種β－受體激動劑用于動物飼養(yǎng)。根據(jù)農(nóng)業(yè)部1025號公告－18－2008《動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》［1］，可以同時檢測動物源性食品中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅和噴布特羅等9種β－受體激動劑殘留量。一個完整的測量結(jié)果，除了給出被測量的最佳估計值之外，還應同時給出與該值相關(guān)的不確定度。為了更合理、更科學地表示測量結(jié)果，依據(jù)JJF1059.1－2012《測量不確定度評定與表示》［2］和CNAS－GL06∶2006《化學分析中不確定度的評估指南》［3］，本研究建立了一套液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肝中β－受體激動劑殘留量不確定度的評定方案。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters UPLC Xevo TQ）；旋渦儀（IKA）；固相萃取裝置（Supelco）；氮吹儀（Organomation）；高速離心機（Beckman）；振蕩器（YAMATO）。

1.2 試劑 乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、氨水，均為分析純；甲醇、甲酸，均為色譜純；實驗用水為超純水。

1.3 標準品 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、噴布特羅（Dr.Ehrenstorfer GmbH），氯丙那林、妥布特羅（WITEGA）、西馬特羅（Sigma Aldrich）、非諾特羅（Toronto Research Chemicals Inc.），純度均大于98%。

1.3.1 標準儲備液（100 μg／mL）的制備 分別準確稱取0.01000 g（精確到±0.00001 g）的特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅和噴布特羅標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，分別配制成100 μg／mL的標準儲備液。

1.3.2 混合標準工作液（0.01 μg／mL）的制備 分別吸取0.1 mL的上述9種β－受體激動劑儲備液（濃度100 μg／mL），置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即成濃度為1 μg／mL的混合標準溶液。

吸取0.1 mL濃度為1 μg／mL混合標準儲備液，用0.2%甲酸水稀釋到10 mL，可得到0.01 μg／mL的混合標準工作液。

1.3.3 空白添加標準曲線的制備 準確稱取2 g（精確到0.01 g）空白試樣于50 mL離心管內(nèi)，分別稱取 5份。分別向其中添加 50、100、200、400、1000 μL混合標準工作液（濃度0.01 μg／mL），制得濃度為0.25、0.5、1、2、5 μg／kg的空白添加試料。按測試樣品處理步驟操作，供超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 測定方法 稱取2 g（精確到0.01 g）測試樣品，加入乙酸銨緩沖溶液8.0 mL，于37℃避光酶解。酶解后高速離心分出上清液，并用高氯酸調(diào)pH后高速離心沉淀蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移出來。上清液用NaOH溶液調(diào)pH后，用乙酸乙酯10 mL和叔丁基甲醚5 mL分別萃取一次。合并兩次萃取有機相，50℃ 下氮氣吹干，用2%甲酸溶液溶解，過MCX固相萃取柱（60 mg／3 mL）凈化，洗脫液氮氣吹干后用0.2%甲酸水溶液1 mL溶解，0.2 μm濾膜過濾后上機測定。

2 測量模型

式中：X—試樣中被測物的殘留量，單位為微克每千克（μg／kg）；

C—樣液中被測物的上機測試濃度，單位為納克每毫升（ng／mL）；

V—凈化液經(jīng)氮氣吹干后的定容體積，單位為毫升（mL）；試驗中V＝1 mL；

m—供試樣品質(zhì)量，單位為克（g）；試驗中m＝2.00 g。

考慮到實驗過程中各種隨機因素對測量結(jié)果的影響，在測量模型中引入重復性系數(shù)frep，建立樣品中β－受體激動劑藥物殘留量不確定度測量模型如下

由測量模型可看出，影響測定結(jié)果不確定度urel（X）的主要因素有：由標準曲線計算樣液中被測物的濃度C引入的不確定度urel（C），凈化液經(jīng)氮氣吹干后定容體積引入的不確定度urel（V），稱量樣品引入的不確定度urel（m），整個實驗重復性（包括提取凈化過程和儀器進樣）的不確定度通過urel（frep）來體現(xiàn)。

由此得到試樣中被測物的殘留量的相對標準不確定度urel（X）可由下式計算：

3 相對標準不確定度分量的評定

3.1 實驗合成重復性的相對標準不確定度urel（frep）按實驗方法平行測定某樣品5次，測得樣品含量為X1～X5，分別計算各藥物平均值和標準偏差測定結(jié)果和計算數(shù)據(jù)見表1。

表1 重復性相對標準不確定度urel（frep）計算結(jié)果表

3.2 樣液中被測物的上機測試濃度C的相對標準不確定度urel（C） 樣液中被測物的上機測試濃度C的相對標準不確定度urel（C）由兩部分構(gòu)成，一是制備空白添加標準曲線產(chǎn)生的不確定度urel（Cs），一是標準曲線擬合出樣液中被測物的濃度產(chǎn)生的不確定度urel（C0）。

3.2.1 制備空白添加標準曲線產(chǎn)生的不確定度urel（Cs）Cs的不確定度主要來源包括：制備標準儲備液引入的不確定度u1（Cs）；配制混標工作液引入的不確定度u2（Cs）；向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液引入的不確定度u3（Cs）。

3.2.1.1 制備標準儲備液引入的相對標準不確定度u1（Cs） 標準儲備液的不確定度主要由標準品稱量、定容和標準品本身的不確定度決定。

（1）標準品稱量引入的相對標準不確定度u11（Cs）

稱量標準品的天平最大允許誤差為±0.05 mg，取均勻分布，天平稱量引入的相對標準不確定度為：

（2）標準液定容引入的相對標準不確定度u12（Cs）

標準品配制使用的100 mL A級容量瓶允差±0.10 mL，取均勻分布，相對標準不確定度：

定容至容量瓶刻度的變動性：重復定容10次，標準偏差為 0.030 mL，相對標準不確定度ur，2（V100mL）＝0.030 mL／100 mL＝0.0003；

假定實驗室溫度在20℃±5℃，20℃時甲醇的體積膨脹系數(shù)［4］為1.1×10－3／℃，均勻分布，溫度引起的相對標準不確定度

相對標準不確定度：

（3）標準品純度引入的相對標準不確定度u13（Cs）

由供應商（或證書）提供的標準品純度引入的相對標準不確定度分別為：西馬特羅0.005，沙丁胺醇0.005，氯丙那林0.005，特布他林0.01，非諾特羅0.005，萊克多巴胺0.01，克侖特羅0.005，妥布特羅0.005，噴布特羅0.01。

3.2.1.2 制備混標工作液（0.01 μg／mL）引入的相對標準不確定度u2（Cs） 按1.3.2項制備混標工作液（0.01 μg／mL），用0.1 mL移液器吸取甲醇溶液2次，10 mL容量瓶用甲醇和水各定容1次。

（1）10 mL容量瓶導致的相對標準不確定度

10 mL容量瓶的相對標準不確定度計算方式類似3.2.1.1項中（2），允差為±0.02 mL，不確定度為定容重復性標準偏差0.015 mL；溫度變動性：溶劑為甲醇時，引起的不確定度為溶劑為水時，引起的不確定度為（20℃時水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10－4／℃）。

用甲醇配制成濃度為1 μg／mL的混合標準溶液時，10 mL容量瓶引入的相對標準不確定度為

用0.2%甲酸水配制成濃度為0.01 μg／mL的混合標準溶液時，10 mL容量瓶引入的相對標準不確定度為

（2）移液器導致的相對標準不確定度

用移液器導致的體積相對標準不確定度主要有3個分量：校準分量ur，1（V）、充液重復性變化分量ur，2（V）和溫度變化分量 ur，3（V），計算方式類似3.2.1.1項中（2）。移液器的容量允許誤差和測量重復性參考JJG 646－2006移液器檢定規(guī)程［5］的要求。

使用移液器引起的體積相對標準不確定度ur（V）計算結(jié)果見表2。

表2 使用移液器引起的體積相對標準不確定度表

制備混標工作液（0.01 μg／mL）時，用100 μL移液器移取0.1 mL甲醇溶液兩次，引入的相對標準不確定度為：

3.2.1.3 向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液引入的相對標準不確定度u3（Cs） 以添加濃度為1 μg／kg的空白添加標準試樣為例，需移取200 μL混合標準工作液（0.01 μg／mL），加入2 g空白試樣中制備而得。該體積導致的相對標準不確定度為0.0046（具體數(shù)據(jù)見表 2）。同理添加成 0.25、0.5、2、5 μg／kg等濃度時相對標準不確定度分別為0.0091、0.0040、0.0041、0.0037。

制備標準曲線引入的相對標準不確定度urel（Cs）分別為：西馬特羅0.0163，沙丁胺醇0.0163，氯丙那林 0.0163，特布他林 0.0184，非諾特羅0.0163，萊克多巴胺0.0184，克侖特羅0.0163，妥布特羅0.0163，噴布特羅0.0184。

3.2.2 標準曲線擬合過程的相對標準不確定度urel（C0）添加5個不同濃度的混合標準樣品0.25、0.5、1、 2、5 μg／kg，按樣品處理步驟操作后上機，對應上機濃度0.5、1、2、4、10 ng／mL，每一濃度測定3次。各種化合物以上機濃度C為橫坐標，譜圖強度峰面積Y為縱坐標，擬合標準曲線，建立數(shù)學模型：Yi＝bCi＋a，計算各化合物線性方程的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

表3 各化合物回歸直線測量結(jié)果表

待測物 標準濃度／（ng·mL－1） 峰面積1 峰面積2 峰面積3 回歸方程 相關(guān)系數(shù)沙丁胺醇0.5 405.024 383.739 368.33 1 573.495 535.341 638.013 2 1940.658 2171.454 2091.345 4 3038.117 3125.19 2907.594 10 10063.54 10296.07 10092y＝1029.6x－361.6 0.9874氯丙那林0.5 1125.286 1032.872 916.502 1 2899.197 2849.437 2938.887 2 7357.09 8197.32 8066.064 4 12925.25 13454.92 13082.16 10 29600.19 28976.34 29749.1y＝2930.4x＋621.6 0.9910特布他林0.5 585.687 643.101 541.462 1 1171.474 1165.059 1186.414 2 2193.133 2330.319 2242.498 4 4786.406 4999.125 4510.367 10 10590.47 10953.27 11216.83y＝1087.9x＋133.3 0.9970非諾特羅0.5 210.68 256.483 237.944 1 365.431 308.511 327.133 2 539.291 515.051 497.52 4 678.222 639.835 699.058 10 1254.06 1364.976 1296.057y＝108.4x＋233.3 0.9841萊克多巴胺0.5 580.691 427.939 449.666 1 1061.072 972.467 838.232 2 1488.638 1569.103 1487.979 4 5157.384 5200.734 4849.987 10 11348.5 11466.23 11315.78y＝1172.7x－223.4 0.9903克侖特羅0.5 1451.178 1314.141 1179.006 1 2363.752 2324.606 1974.859 2 4030.21 4034.107 3913.252 4 9356.196 9729.781 9013.767 10 19744.08 19879.11 19535.05y＝1956.2x＋476.1 0.9930妥布特羅0.5 2494.644 2450.379 2560.842 1 6625.915 6752.771 6646.904 2 16973.52 16652.32 17013.38 4 29532.29 29873.28 28732.03 10 68115.79 69721.36 67502.93y＝6834.7x＋855.2 0.9954噴布特羅0.5 233.052 214.376 235.84 1 346.299 347.864 409.514 2 795.891 476.065 570.434 4 1094.66 1335.984 1272.839 10 2996.746 2860.948 2832.191y＝282.0x＋81.1 0.9925

被測樣品2次平行測定后，通過擬合直線求出SR和各化合物濃度C0，根據(jù)公式（1）計算出被測樣品中所含各待測物殘留量X0，按（3）式計算各待測物濃度的標準不確定度u（C0）。

其中Yi—標準溶液的峰面積測定值；

Ci—標準溶液的濃度值；

b—擬合直線的斜率；

a—擬合直線的截距；

n—標準溶液測試次數(shù)，本實驗中n＝15；

p—C0測試次數(shù)，本實驗中p＝2；

C0—由線性方程計算得各化合物濃度；

表4 濃度C的不確定度計算的有關(guān)量值表

3.3 定容體積的相對標準不確定度urel（V） 用移液器定容至1 mL，根據(jù)表2，urel（V）＝ 0.0037。

3.4 稱量樣品的相對標準不確定度urel（m） 稱量樣品的天平最大允許誤差：±5 mg，采用均勻分布，2.00 g＝0.0014。

3.5 合成標準不確定度 urel（X）及擴展不確定度Urel（X） 根據(jù)公式（2）計算合成標準不確定度，取包含因子k＝2，則相對擴展不確定度Urel（X）＝k× urel（X），結(jié)果見表5。

表5 合成標準不確定度的有關(guān)量值表

4 不確定度報告

依據(jù)農(nóng)業(yè)部1025號公告－18－2008對豬肝樣品中β－受體激動劑殘留量進行檢測，對樣品平行測定2次，取包含因子k＝2，測定結(jié)果見表6。

表6 豬肝中β－受體激動劑殘留量檢測結(jié)果表

5 結(jié)論

從以上分析數(shù)據(jù)可以看出，實驗過程中，樣品稱量和最終定容體積引入的不確定度極小，可忽略不計，影響測定結(jié)果不確定度的主要因素為標準曲線和樣品的測量重復性。所以測試過程中，要嚴格控制實驗條件，保證標準曲線具有良好的線性以及實驗具有良好的重復性，才能有效的保證檢測結(jié)果的準確性。

［1］農(nóng)業(yè)部1025號公告－18－2008.動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［2］JJF1059.1－2012.測量不確定度評定與表示［S］.

［3］CNAS－GL06：2006.化學分析中不確定度的評估指南［S］.

［4］李蘭英，丁 敏，徐 勤，等.LC－MS／MS測定豬尿中鹽酸克倫特羅不確定度的評定［J］.中國計量學院學報，2012，23（1）：7－12.

［5］JJG 646－2006.移液器檢定規(guī)程［S］.

（編 輯：侯向輝）

Uncertainty Evaluation of β－Agonists in Pork Liver by Ultra Performance Liquid Chromatography－tandem Mass Spectrometry

HUANG Xue－ying，QI Min，SHEN Dan，ZHONG Jin－h(huán)ui，HU Mai－ling，TAN Nuo
（Guangzhou Animal Health Inspection Institute，Guangzhou510440，China）

Evaluation on uncertainty of measurement in the determination of 9 kinds of β－agonists in pork liver by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry was practiced.The main factors，including standard solution，standard curve，weighing of sample，measurement repeatability，and volume were evaluated.The combined uncertainty of 9 kinds of β－agonists was in the range of 5.60%～8.90%.The results showed that the measurement uncertainty was mainly due to the standard curve and measurement repeatability.

uncertainty；β－agonists；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLCMS／MS）

2014－11－03

A

1002－1280（2015）01－0045－07

S859.84

黃雪英，碩士，從事獸藥殘留檢測技術(shù)研究。E－mail：ssherry109＠163.com