清瘟敗毒散超微粉中黃芩苷的薄層鑒別和含量測定研究

王 林，馬 霞，郭振環(huán)，張國祖?，金燕飛，王文文

（1.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南中牟451464；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，鄭州450011）

清瘟敗毒散超微粉中黃芩苷的薄層鑒別和含量測定研究

王 林1，馬 霞2，郭振環(huán)1，張國祖2?，金燕飛1，王文文1

（1.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南中牟451464；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，鄭州450011）

分別建立了清瘟敗毒散超微粉中黃芩苷的薄層鑒別方法和含量測定方法。采用聚酰胺薄膜為薄層板，乙酸乙酯－甲酸（6∶1）為展開劑，1%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，可快速鑒別出黃芩苷成分。高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為Hypersil ODS2 C18，流動相為甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2，檢測波長為280 nm。結(jié)果顯示，黃芩苷在12～72 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.12%。黃芩苷在清瘟敗毒散超微粉中的含量相對較高，且穩(wěn)定可靠，可以作為質(zhì)量控制的指標(biāo)。

清瘟敗毒散超微粉；黃芩苷；薄層鑒別；含量測定

清瘟敗毒散是清代著名溫病學(xué)家余師愚所創(chuàng)制的名方，載于其所著的《疫疹一得》一書中，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版二部。本藥由石膏、生地黃、黃芩等14味藥材組成，是“白虎湯”、“黃連解毒湯”和“犀角地黃湯”三方加減化裁而得。清瘟敗毒散具有清熱瀉火、涼血解毒之功效，在獸醫(yī)臨床上廣泛用于畜禽流行性出血熱、敗血癥、毒血癥、尿毒癥等疾?。?］。

中藥超微粉是利用超微粉碎技術(shù)得到的中藥超細(xì)粉，藥物顆粒細(xì)度達(dá)到48 μm以下，細(xì)胞破壁率達(dá)到85%以上。其優(yōu)勢在于增加有效成分溶出率，提高生物利用度，減少用藥量等。清瘟敗毒散超微粉綜合了清瘟敗毒散和中藥超微粉的優(yōu)勢，使清瘟敗毒散藥理作用得到最大發(fā)揮，不僅明顯降低用藥成本，且無污染、無殘留，在獸醫(yī)臨床應(yīng)用潛力巨大［2－3］。

目前清瘟敗毒散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別和黃連的薄層鑒別，很難完全控制藥物的質(zhì)量。此外，有關(guān)黃芩苷的薄層鑒別和含量測定研究多見于提取物、顆粒劑或口服液等劑型［4－5］，鮮有散劑或超微粉制劑的相關(guān)研究。因此，本試驗研究了清瘟敗毒散超微粉中黃芩主要成分黃芩苷的薄層鑒別和含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

P230型高效液相色譜儀（配置紫外檢測器），大連伊力特公司；AUW220D1電子天平，島津國際貿(mào)易有限公司；GZX－9030 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

清瘟敗毒散（批號14030201，河南省康星藥業(yè)股份有限公司）；清瘟敗毒散超微粉（實驗室自制，用超微粉碎技術(shù)將批號為14030201的清瘟敗毒散粉碎至95%顆粒在48 μm以下）；黃芩苷對照品（批號110715－201016，含量94.0%，中國食品藥品檢定研究院）；聚酰胺薄膜（上海鑫楚實業(yè)有限公司）。

2 方法

2.1 黃芩苷的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取清瘟敗毒散及其超微粉各5 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品10 mg，加乙醇溶解，定容至10 mL，制備成每1 mL含1 mg的對照品溶液。

2.1.3 黃芩陰性樣品溶液的制備 按清瘟敗毒散超微粉的處方和生產(chǎn)工藝制備不含黃芩的陰性樣品，稱取 5 g，按供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

2.1.4 薄層色譜法試驗 分別吸取上述溶液各5 μL，點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯－甲酸（6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。觀察供試品溶液和陰性樣品溶液在對照品位置是否出現(xiàn)相同的斑點。

2.1.5 實際樣品的薄層鑒別 取批號為14030201的清瘟敗毒散和超微粉樣品，按照上述薄層鑒別方法處理，考察藥材的不同粉碎程度對黃芩苷薄層鑒別的影響。

2.2 黃芩苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Hypersil ODS2C18（5 μm，4.0 mm×150 mm）；流動相為甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2）；流速 1.0 mL／min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品12.77 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL量瓶中，得到1 mL含120 μg的溶液。精密吸取5 mL，定容至10 mL量瓶中，制成每1 mL含60 μg的對照品溶液，進樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.2.3 供試品溶液的制備 取清瘟敗毒散超微粉3 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得，進樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按清瘟敗毒散超微粉的處方和生產(chǎn)工藝制備不含黃芩的陰性樣品，稱取4.8 g，按照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 專屬性試驗 按照2.2.1色譜條件，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜進行檢測。觀察在對照品出峰位置，供試品溶液和陰性樣品溶液是否出現(xiàn)保留時間一致的色譜峰，以考察方法的專屬性。

2.2.6 線性關(guān)系的考察 取120 μg／mL的對照品溶液，用甲醇稀釋成72、60、48、30、12 μg／mL系列濃度。按濃度由低到高，吸取10 μL進樣，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸。記錄回歸方程和線性系數(shù)，考察線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 取60 μg／mL的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，統(tǒng)計相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察系統(tǒng)的精密度。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批次清瘟敗毒散超微粉樣品，稱取6份，按照供試品制備方法處理，分別進高效液相色譜儀分析。計算含量，統(tǒng)計RSD，考察方法的重復(fù)性。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取清瘟敗毒散超微粉樣品，按照供試品制備方法處理，于處理后的0、3、6、9、12、24 h分別進樣。記錄峰面積，計算RSD，考察方法的穩(wěn)定性。

2.2.10 回收率試驗 取已知含量（0.573%）的清瘟敗毒散超微粉樣品，稱取9份，每份1.5 g，3份為1組。分別加入適量黃芩苷對照品，使3組的添加藥量為原有藥量的80%、100%和120%。按照供試品制備方法處理，用高效液相色譜儀分析，計算黃芩苷含量，統(tǒng)計平均回收率和RSD。

2.2.11 供試品含量測定 取批號為14030201的清瘟敗毒散粉碎得到的超微粉樣品，按照上述建立的方法處理，測定超微粉樣品中黃芩苷的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芩苷的薄層鑒別 黃芩苷對照品、黃芩陰性樣品、清瘟敗毒散和清瘟敗毒散超微粉的薄層鑒別結(jié)果如圖1，結(jié)果表明該方法陰性無干擾，可以用來鑒別兩種劑型中的黃芩苷。

圖1 黃芩苷的薄層鑒別圖

3.2 黃芩苷的含量測定

3.2.1 專屬性試驗 在上述色譜條件下，供試品溶液出現(xiàn)黃芩苷的藥物峰，保留時間約為13 min，黃芩陰性樣品在藥物峰處無干擾，說明方法專屬性較好。對照品溶液、陰性樣品溶液、清瘟敗毒散超微粉樣品的色譜圖見圖2－圖4。

圖2 黃芩苷對照品

圖3 黃芩苷陰性樣品

圖4 清瘟敗毒散超微粉樣品

3.2.2 線性關(guān)系考察 黃芩苷的線性回歸方程為y＝79.513x－15.561，線性系數(shù)r＝0.9993，表明在12～72 μg／mL濃度范圍內(nèi)黃芩苷濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

3.2.3 精密度和重復(fù)性試驗 對照品連續(xù)進樣6次，峰面積的RSD為1.3%；同一批次樣品重復(fù)測定6次，平均含量為0.574%，RSD為3.2%。表明方法的精密度和重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h測定，結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.21%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 回收率試驗 加樣回收試驗測定結(jié)果見表1。該方法平均回收率99.12%，RSD為1.98%，回收率較高，滿足含量測定要求。

3.2.6 供試品含量測定 清瘟敗毒散超微粉樣品重復(fù)測定3次，平均含量為0.579%。黃芩苷在該復(fù)方中的含量較高，可以作為清瘟敗毒散超微粉的主要檢測指標(biāo)。

表1 回收率試驗結(jié)果

4 討論

黃芩苷的薄層鑒別研究分別嘗試了硅膠G板和聚酰胺薄膜，發(fā)現(xiàn)其它條件相同條件下，兩種薄層板都可以很好的鑒別出黃芩苷成分。因此，本鑒別方法可以用硅膠G板代替聚酰胺薄膜。此外，本試驗對文獻中不同的展開劑進行了篩選，分別選用乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水（5∶3∶1∶1）［6］、甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶3∶1∶2）［7］、乙酸乙酯－甲酸（6∶1）進行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯－甲酸（6∶1）為展開劑的斑點較為清晰，且與雜質(zhì)斑點分離較好。此外，該展開劑配制簡單，也避免用到毒性較大的溶劑。

研究中黃芩苷的含量測定方法主要參考了《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版黃芩藥材的測定方法［7］。分別從稱樣量、稀釋倍數(shù)、進樣量等條件進行優(yōu)化，得到了穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的含量測定方法。黃芩在處方中的所占比例為5.21%，而二○一○年版獸藥典規(guī)定黃芩藥材中黃芩苷含量不得低于9.0%?？梢哉J(rèn)為，清瘟敗毒散超微粉中黃芩苷含量超過0.469%即為合格。因此，本試驗檢測的清瘟敗毒散超微粉為合格樣品。黃芩苷在該復(fù)方中的含量相對較高，可以作為質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。

本試驗嘗試檢測相同藥材來源的清瘟敗毒散中黃芩苷的含量，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果比超微粉含量低10%左右，說明該提取方法不能將黃芩苷從散劑中充分提取出來，不適合清瘟敗毒散散劑的含量測定。但從另一方面看，中藥進行超微粉碎后，細(xì)胞破壁增多，有效成分溶出量增加，提取率必然提高［8］。黃一帆等［9］比較了普通粉碎和超微粉碎對黃連解毒湯中黃芩苷溶出量的影響，發(fā)現(xiàn)相同提取條件下超微粉的溶出量比細(xì)粉提高32%以上，這與本試驗結(jié)果相一致。在獸醫(yī)臨床中，超微粉的這種優(yōu)勢提高了中藥的生物利用度，也降低了用藥成本。因此，預(yù)期中藥超微粉會成為未來中獸藥發(fā)展的一個重要方向。

［1］吳元才.加味清瘟敗毒散防治豬高熱病的臨床試驗［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2008，（3）：18－19.

［2］周希平，付夫根.中藥超微粉在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用前景［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2011，（2）：53－54.

［3］李 茜，侯海鋒.中藥超微粉在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用前景［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（S）：260－262.

［4］彭小萍.熱感寧膠囊中黃芩苷含量的測定［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，（5）：57－58.

［5］蔣俊毅，李 祥，邱蓉麗，等.消炎靈口服液中黃芩苷含量的測定［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2005，3（1）：54－56.

［6］王 野.小兒感冒寧糖漿的薄層鑒別及黃芩苷的含量測定［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，29（2）：59－64.

［7］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部［S］.

［8］張國祖，王 林，于 瑞，等.不同條件對扶正解毒散及其超微粉有效成分溶出影響的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（11）：148－150.

［9］黃一帆，李富文，馬玉芳，等.超微粉碎對黃連解毒湯中黃芩苷溶出的影響［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，33（2）：215－218.

（編 輯：陳 希）

Study on the TLC Identification and Quantitative Determination of Baicalin in Qingwen Baidu San Ultra－Fine Powder

WANG Lin1，MA Xia2，GUO Zhen－h(huán)uan1，ZHANG Guo－zu2?，JIN Yan－fei1，WANG Wen－wen1
（1.Henan Kangxing Pharmaceutical Co.，Ltd，Zhongmou，Henan451464，China；2.Henan University of animal husbandry＆economy，Henan450011，China）

A TLC identification method and a quantitative determination mthod were established for baicalin in Qingwen Baidu San ultra－fine powder.The polyamide chromatography plate was used，developing solvent was acetidine－formic acid（6∶1）and the chromogenic agent was 1%ferric chloride ethanol solution.In this condition，baicalin was identified quckly.The HPLC methods were as follows：chromatographic column was Hypersil ODS2 C18，mobile phase was methanol－water－phosphate（47∶53∶0.2），and the detective wavelength was 280 nm.Results showed that baicalin had good linear relationship in the range of 12～72 μg／mL，the average recovery rate was 99.12%.The content of baicalin in Qingwen Baidu San ultra－fine powder was high and stable，so it can be used as the quality index.

Qingwen Baidu San ultra－fine powder；baicalin；TLC identification；quantitative determination

2014－09－26

A

1002－1280（2015）01－0033－04

S853.72

河南省重點科技攻關(guān)項目（122102110185，122102110224），河南省成果轉(zhuǎn)化項目（132201310002）

王 林，碩士，從事中獸藥開發(fā)與應(yīng)用研究。

張國祖。E－mail：zhangguozu＠126.com