UPLC－MS／MS檢測2種中獸藥制劑中非法添加慶大霉素的研究

劉雪紅，張秀芹，喬 穎，孟 晨，王 馳，陳 玲，季 磊，張藝多

（1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037；2.遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽110000）

UPLC－MS／MS檢測2種中獸藥制劑中非法添加慶大霉素的研究

劉雪紅1，張秀芹2，喬 穎1，孟 晨1，王 馳1，陳 玲1，季 磊1，張藝多1

（1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037；2.遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽110000）

應(yīng)用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了獸用中藥制劑穿心蓮注射液和魚腥草注射液中非法添加慶大霉素的檢測方法。樣品經(jīng)水溶解后稀釋，采用20 mmol／L七氟丁酸（HFBA）乙腈與20 mmol／L HFBA水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)ACQUITY HSS PFP色譜柱分離，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行測定。慶大霉素在0.02～2 μg／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)0.9998。平均回收率為98.2%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.4%。檢測限為2 mg／mL，定量限為4 mg／mL，該法準(zhǔn)確、簡單、快速。

中獸藥制劑；慶大霉素；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜

慶大霉素（Gentamycin）為氨基糖苷類抗生素，對各種腸桿菌科細(xì)菌有良好抗菌作用。在畜禽養(yǎng)殖中，一般用于治療細(xì)菌性感染，例如流行性腹瀉、仔豬副傷寒、仔豬黃白痢、禽大腸桿菌病、禽傷寒、副傷寒等腸道疾病。因其良好的治療作用，被添加到一些獸用中藥制劑中，以增加中藥制劑的治療效果。非法添加使得養(yǎng)殖戶在不知情的情況下使用抗生素，不僅誘導(dǎo)畜禽產(chǎn)生耐藥性，而且導(dǎo)致藥物在動物源食品中的殘留，危害人體健康。它在動物性食品中的殘留對人體具有潛在危害，可引起聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感等耳毒性反應(yīng)，及腎毒性反應(yīng)和神經(jīng)肌肉阻滯等。目前，沒有針對中獸藥制劑中非法添加慶大霉素的檢測方法，本文對該檢測方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD－200，德國Sartorius公司；超聲波清洗機；渦旋振蕩器；XEVO TQ－S ACQUITY UPLC超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司；色譜柱ACQUITY HSS PFP，2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 慶大霉素，批號30930 C14000200，含量94.4%，德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 陰性對照注射液 魚腥草注射液：天長市天洋獸藥有限公司，批號：140326；穿心蓮注射液：成都科銳動物藥業(yè)有限公司，批號：20140222，經(jīng)檢測均不含慶大霉素。

1.2.2.2 陽性添加注射液 分別按照1%、2%、4%的比例在陰性對照注射液中添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。

1.2.3 試劑 乙腈色譜純，七氟丁酸（HFBA）優(yōu)級純，水為符合GB／T 6682－1992規(guī)定的一級水。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，以水定容至25 mL，混勻，即為1000 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；4℃保存于塑料試管中，有效期為3個月。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 精密量取1.2.4項下標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，置100 mL容量瓶中，以水定容至刻度。混勻，制成濃度為10 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，保存于塑料試管中。

1.3 測定方法

智慧社區(qū)建設(shè)必然面臨智能化硬件、自動化基礎(chǔ)設(shè)施、數(shù)據(jù)機房等設(shè)備的應(yīng)用，耗能問題無法回避，5G的出現(xiàn)極大地減少了為提升網(wǎng)速和傳輸效率進(jìn)行的網(wǎng)絡(luò)布線和電力消耗，讓能源、資源的利用更高效，使得智慧社區(qū)的能耗控制更加精準(zhǔn)，設(shè)備反應(yīng)更加及時，可以有效減少資源的浪費。

1.3.1 樣品處理 精密移取中獸藥注射劑5 mL，置100 mL容量瓶中，以水定容至刻度，超聲5 min，精密移取溶液1 mL加水，定容至100 mL；精密移取1 mL加水，定容至50 mL，過0.22 μm濾膜后，加入1.5 μL HFBA于進(jìn)樣瓶中供測定用。

1.3.2 液相色譜條件 柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式：正離子，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，霧化器壓力：0.7 MPa，干燥氣流量：800 L／h，干燥氣溫度：400℃，毛細(xì)管電壓：3000 V。定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表1 梯度洗脫程序表

表2 定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量表

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級稀釋，以水定容配制成濃度分別為0.02、0.05、0.2、0.5、2 μg／mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加入1.5 μL HFBA于進(jìn)樣瓶中，混勻后上機測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)。慶大霉素在0.02～2 μg／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 檢測限和定量限 陰性對照注射液按1.3.1項的方法步驟處理后，測定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時間，陰性對照注射液對所測藥物無干擾。添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于5 mL陰性對照注射液中，經(jīng)提取后測定，慶大霉素的信噪比均S／N＞10，表示方法的定量限為4 mg／mL。添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于5 mL陰性對照注射液中，經(jīng)提取后測定，慶大霉素的信噪比均S／N＞3，表示方法的檢測限為2 mg／mL。兩種對照注射液的陰性及添加慶大霉素定量限濃度MRM譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 魚腥草陰性對照注射液及添加慶大霉素定量限濃度MRM色譜圖

圖3 穿心蓮陰性對照注射液及添加慶大霉素定量限濃度MRM色譜圖

2.3 精密度試驗 取0.2 μg／mL慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果表明6次重復(fù)進(jìn)樣的RSD為0.2%，外標(biāo)法測定慶大霉素具有良好的重現(xiàn)性。

表3 添加不同濃度慶大霉素回收率及重復(fù)性試驗結(jié)果表 （n＝6）

2.5 穩(wěn)定性試驗 取上述2.4項下制備的供試液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，樣品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測方法的選擇 慶大霉素的定量檢測，常用微生物法、高效液相色譜法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中微生物法，過程復(fù)雜費時，干擾較多，專屬性較低［1］。高效液相色譜法，需要柱后衍生化，較為繁瑣［2］。本文采用的LC／MS／MS法，靈敏度高、選擇性強；且在本文色譜條件下，不到5 min便可將樣品中的慶大霉素檢測，測試快速，分析周期短。

3.2 中獸藥制劑種類的選擇 魚腥草注射液具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等功效，用于治療痢疾、乳癰、淋濁等。穿心蓮注射液具有清熱解毒功效，主治腸炎、肺炎、仔豬白?。?］。慶大霉素是一種常見的獸藥產(chǎn)品，對各種腸桿菌科細(xì)菌有良好抗菌作用，常用于治療仔豬黃白痢、腹瀉等，在畜禽養(yǎng)殖中極可能被添加到中獸藥制劑中增強抗菌療效。故選穿心蓮注射液和魚腥草注射液作為檢測對象。

3.3 樣品處理方法的選擇 中藥制劑與肌肉、肝、血液等樣品相比，無蛋白及脂肪的干擾，無需過固相萃取柱凈化［4－5］。且中獸藥制劑添加量較大，無需濃縮。按本文方法處理樣品，無基質(zhì)干擾，方法簡單、快速，回收率高。

3.4 添加回收率試驗濃度的選擇 根據(jù)2種中獸藥注射劑及慶大霉素的治療用量，選擇添加1%、2%、4%慶大霉素作為添加回收試驗濃度，符合非法添加的實際情況，測定回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

本方法確立的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，可檢測中獸藥注射劑魚腥草注射液和穿心蓮注射液中非法添加的慶大霉素。檢測限及定量限均能滿足要求。樣品處理簡單，快速，檢測方法準(zhǔn)確、可靠。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版（一部）［S］.

［2］農(nóng)業(yè)部1163號公告－7－2009.動物性食品中慶大霉素殘留檢測 高效液相色譜法［S］.

［3］中國獸藥典委員會.獸藥國家標(biāo)準(zhǔn) 化學(xué)藥品、中藥卷 （第一冊）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013.

［4］孫 雷，張 驪，黃耀凌，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源食品中8種氨基糖苷類藥物殘留［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2009，30（1）：60－64.

［5］張 強，廖工鐵，壽 旦，等.用高效液相色譜法測定兔血漿中硫酸慶大霉素的含量［J］.上海：中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1995，15（4）：147.

（編 輯：侯向輝）

Detection of Illegally Added Gentamycin in 2 Kinds of Traditional Chinese Medicine for Animals by UPLC－MS／MS

LIU Xue－h(huán)ong1，ZHANG Xiu－qin2，QIAO Ying1，MENG Chen1，WANG Chi1，CHEN Ling1，JI Lei1，ZHANG Yi－duo1
（1.Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Dalian，Liaoning116037，China；2.Liaoning Province Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Shenyang110000，China）

A method of Ultra－HPLC－MS／MS was developed to determine gentamycin illegally added in traditional Chinese medicine for animals.The samples were dissolved and diluted.The HPLC separation was performed on ACQUITY HSS PFP column with a linear gradient elution program of 20 mmol／L HFBA acetonitrile and 20 mmol／L HFBA aqueous solution as the mobile phase.Selective reaction monitoring was used for the selective detection.The linearity of gentamycin ranged from 0.02 to 2 μg／mL with coefficient 0.9998.The average recovery was within the range of 98.2%～100.3%andRSDwere less than 2.4%.The limit of detection was 2 mg／mL and limit of quantification was 4 mg／mL.The method was accurate，convenient and fast.

traditional Chinese medicine for animals；gentamycin；Ultra－HPLC－MS－MS

2014－10－22

A

1002－1280（2015）01－0041－04

S859.83

劉雪紅，副主任藥師，從事獸藥及獸藥殘留的檢驗工作。E－mail：liuxuehongyi＠163.com