糙米培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體技術(shù)及其有效成分含量測(cè)定

莫炫永,陳涌濤

(1.東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心，廣東 東莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武漢 430071)

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糙米培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體技術(shù)及其有效成分含量測(cè)定

莫炫永1,陳涌濤2*

(1.東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心，廣東 東莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武漢 430071)

冬蟲(chóng)夏草是一種非常名貴的中藥材，主產(chǎn)于我國(guó)青藏高原，有神山圣草和中藥之王的美譽(yù)，在傳統(tǒng)醫(yī)藥中占據(jù)重要地位。但近幾年，由于過(guò)度采挖和生態(tài)環(huán)境的惡化，野生資源幾近枯竭，而蟲(chóng)草的人工養(yǎng)殖卻一直沒(méi)有取得突破，因此尋找其替代品十分重要。探討糙米培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體技術(shù)并對(duì)人工培養(yǎng)的蟲(chóng)草菌絲體的有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定。

冬蟲(chóng)夏草；替代品；蟲(chóng)草菌絲體；人工培養(yǎng)；有效成分；含量測(cè)定

冬蟲(chóng)夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc]為我國(guó)名貴的傳統(tǒng)滋補(bǔ)強(qiáng)身中藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其含有多種生物活性物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、降血壓、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗衰勞等多種藥理作用。冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在磷翅目昆蟲(chóng)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體，是青藏高原地區(qū)的特有物種，主產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、四川、云南、甘肅等地[2-3]。近年來(lái)由于過(guò)度采挖，導(dǎo)致蟲(chóng)草野生資源日益枯竭和高原地區(qū)本已脆弱的生態(tài)環(huán)境惡化，并且高額的利潤(rùn)也造成了蟲(chóng)草行業(yè)的種種亂象，一些假冒偽劣產(chǎn)品充斥市場(chǎng)，甚至一些街頭廣告也宣稱出售正宗野生冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)品，給廣大消費(fèi)者、患者造成嚴(yán)重?fù)p失。因此，開(kāi)發(fā)蟲(chóng)草人工養(yǎng)殖技術(shù)或替代品，保護(hù)消費(fèi)者利益，保護(hù)蟲(chóng)草野生資源和高原生態(tài)環(huán)境非常重要。冬蟲(chóng)夏草在青藏高原特有的氣候條件下生長(zhǎng)，這些條件都很難用人造環(huán)境再現(xiàn)，這是冬蟲(chóng)夏草的人工養(yǎng)殖一直沒(méi)有取得有效突破的原因之一。但是冬蟲(chóng)夏草的有效成分大多在它的菌絲體或子實(shí)體中，只要能夠培養(yǎng)出合格的菌絲體或子實(shí)體，也能達(dá)到人工培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草的目的,這也是現(xiàn)今國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)[4]。 本研究對(duì)糙米培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體技術(shù)進(jìn)行了實(shí)用化嘗試，并對(duì)人工培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體主要有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 材料與儀器

玻璃瓶為蟲(chóng)草子實(shí)體培養(yǎng)器，可以選用透明罐頭瓶；冬蟲(chóng)夏草二代菌絲體為特意研發(fā)的適宜在稻米中培養(yǎng)的冬蟲(chóng)夏草菌種C963，母體來(lái)自西藏那曲；紫外燈消毒箱；冰箱；接種工具；酒精燈；糙米；高壓鍋；馬鈴薯；恒溫箱；加濕器；干濕溫度計(jì)；振蕩培養(yǎng)箱。

2 方法與結(jié)果

蟲(chóng)草菌種很容易受到雜菌感染，所以必須全方位嚴(yán)格消毒，整個(gè)操作過(guò)程均在紫外燈下進(jìn)行。將接種工具和培養(yǎng)器瓶口用酒精燈外焰快速烘烤以殺菌。蟲(chóng)草菌種必須低溫避光保存，裝有蟲(chóng)草菌原種的試管，用三層以上包裝紙包裹，在冰箱里保存，溫度控制在-18℃以下，在這個(gè)溫度，菌種將處于休眠狀態(tài)。

2.1 菌種培養(yǎng)

蟲(chóng)草菌種在高溫下無(wú)法存活，因此，必須要等接種工具冷卻后才能使用。將少許菌種取出，注入培養(yǎng)器中，培養(yǎng)器中已預(yù)先配有專用培養(yǎng)液，接種后立即封閉瓶口。接下來(lái)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，將接種后的培養(yǎng)器放于振蕩培養(yǎng)箱中。恒溫培養(yǎng)即低溫恒溫培養(yǎng)，是模擬冬蟲(chóng)夏草的野生環(huán)境，在避光條件下進(jìn)行，培養(yǎng)過(guò)程中溫度控制在16～18℃，振蕩培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速設(shè)定在140r/min。待培養(yǎng)器中出現(xiàn)顆粒狀菌球，菌種培養(yǎng)工作即完成，菌種培養(yǎng)的周期為3～5天。

2.2 子實(shí)體培養(yǎng)

蟲(chóng)草子實(shí)體培養(yǎng)器選用透明玻璃瓶，以便于觀察生長(zhǎng)境況。本實(shí)驗(yàn)中，蟲(chóng)草子實(shí)體培養(yǎng)基選用糙米，因?yàn)槲覈?guó)是稻米生產(chǎn)大國(guó)，在糧食運(yùn)輸、加工過(guò)程中不可避免會(huì)產(chǎn)生碎米或殘次米，再加上色選機(jī)選出的雜色米和倉(cāng)庫(kù)里堆積的陳米，糧食企業(yè)每年都要為大量糙米的處理發(fā)愁，以往一般都是低價(jià)處理，附加值很低。本研究能有效提高糙米的附加值，提高糧食的利用率。因此，本研究特意研發(fā)了適宜在稻米中培養(yǎng)的冬蟲(chóng)夏草菌種C963，以及適合在稻米上生長(zhǎng)的冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)基配方。當(dāng)然，糙米不能直接作為培養(yǎng)基，還要進(jìn)行加工，需要加入土豆湯以及其他一些添加劑，才能有助于營(yíng)養(yǎng)成分的釋放。糙米專用營(yíng)養(yǎng)湯配好后，精密量取55mL湯汁，倒入已經(jīng)裝有50g糙米的玻璃瓶中，再用特殊塑料薄膜將瓶口封閉，這種特殊塑料薄膜帶有4個(gè)小孔，是一種單透膜，即空氣或水分只能從一個(gè)方向通過(guò)，封口時(shí)讓膜的通氣由瓶?jī)?nèi)到瓶外。

接下來(lái)，將封口后的玻璃瓶碼放起來(lái)，送入大型高壓鍋中加熱至124℃，經(jīng)50min殺菌滅活后出鍋；或加熱至糙米蒸熟、土豆湯基本蒸干為宜，這時(shí)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作即完成。

下一步是給培養(yǎng)基接種，因?yàn)橄x(chóng)草菌種不耐高溫，這項(xiàng)工作要等培養(yǎng)基完全冷卻后才能進(jìn)行。接種前仍然要先嚴(yán)格消毒，整個(gè)接種工作都要在紫外燈下進(jìn)行。點(diǎn)燃酒精燈，將接種工具在酒精燈外焰上快速烘烤，待接種工具冷卻后從菌種瓶?jī)?nèi)取出少許菌種，打開(kāi)裝有培養(yǎng)基的玻璃瓶封口，滴入菌種，快速重新裝上封口。接好種的玻璃瓶要分開(kāi)碼放，以免混淆。

辟出專門的蟲(chóng)草培養(yǎng)間，嚴(yán)格消毒，裝上空調(diào)、加濕器、溫度計(jì)等設(shè)備，準(zhǔn)備一些貨架。與菌絲體培養(yǎng)需要避光不同，子實(shí)體培養(yǎng)需要采光。將接好種的玻璃瓶整齊碼放至貨架上，調(diào)整空調(diào)和加濕器，控制溫度20℃、濕度80%。子實(shí)體培養(yǎng)期間，人員除例行檢查外，盡量少進(jìn)入培養(yǎng)間，以減少雜菌感染。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基長(zhǎng)出了一些黑色的東西，表明受到了感染，如果是早期，剔除這些雜菌斑即可，若感染嚴(yán)重應(yīng)盡快將整瓶移走，以免發(fā)生傳染。

研究表明，只要技術(shù)到位，2個(gè)多月就可以長(zhǎng)出理想的蟲(chóng)草子實(shí)體。但這些人工培養(yǎng)的蟲(chóng)草子實(shí)體藥性如何還有待檢驗(yàn)。因?yàn)橄佘蘸拖x(chóng)草素是蟲(chóng)草的重要活性成分，其含量測(cè)定對(duì)人工培育蟲(chóng)草的質(zhì)量控制有重要意義。以下對(duì)這兩種有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定，以檢驗(yàn)人工培養(yǎng)蟲(chóng)草子實(shí)體技術(shù)的實(shí)用價(jià)值。

2.3 蟲(chóng)草有效成分含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)儀器包括Agilent 1200 RRLC-UV-ELSD高效液相色譜儀，賽多利斯萬(wàn)分之一電子天平,OpenLAB EZchrom色譜數(shù)據(jù)管理系統(tǒng);KQ-600超聲波清洗器;WR-2001型溶劑過(guò)濾器,0.2μm濾膜,試劑均為分析純,水為3次蒸餾水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:稱取腺苷、蟲(chóng)草素對(duì)照品適量,置于同一容量瓶中,加乙醇∶水(1∶1)溶液,超聲波振蕩溶解,定容,配制成濃度分別為50.5mg·L-1、129.0mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

蟲(chóng)草素(C10H13O3N5)和蟲(chóng)草腺苷(C10H13N5O4)是從蟲(chóng)草中分離得到的一類具有生物活性的化合物[5]。本研究采用HPLC法測(cè)定人工培養(yǎng)蟲(chóng)草子實(shí)體和天然冬蟲(chóng)夏草中蟲(chóng)草素和腺苷的含量，以Waters XTerra MS C18(4.6mm×250mm，5μm)為色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm，柱溫為25℃，結(jié)果人工培養(yǎng)蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素和腺苷含量分別為1 089.57μg/g、520.00μg/g。冬蟲(chóng)夏草中蟲(chóng)草素和腺苷含量分別為

值接近甚至高于冬蟲(chóng)夏草，可將人工培養(yǎng)菌絲體作為天然冬蟲(chóng)夏草的替代品。色譜見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 野生蟲(chóng)草色譜

圖2 人工培育蟲(chóng)草色譜

3 結(jié)語(yǔ)

野生冬蟲(chóng)夏草由于被盲目無(wú)節(jié)制采挖，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài)，以人工培育的蟲(chóng)草子實(shí)體代替野生冬蟲(chóng)夏草，既保持了環(huán)境資源的可持續(xù)發(fā)展，又降低了用藥成本，不僅有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且有重要的社會(huì)效益。本研究表明人工培育的蟲(chóng)草子實(shí)體在某些藥理作用方面可以替代野生冬蟲(chóng)夏草，但由于實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)方法的局限，對(duì)人工培育蟲(chóng)草子實(shí)體替代冬蟲(chóng)夏草還需進(jìn)一步深入研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].第3版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:432.

[3] 蔣三俊.冬蟲(chóng)夏草及蛹蟲(chóng)草寄主昆蟲(chóng)資源[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2001(5):15.

[4] 康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].第2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:431.

[5] 張甲生,馬冰茹,何玲,等.蠶蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草中無(wú)機(jī)元素的比較[J].中國(guó)食用菌,10(20):43-44.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2015-05-10

莫炫永(1974-)，男，碩士，廣東省東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心主管藥師，研究方向?yàn)樗幤?、保健食品質(zhì)量控制。

陳涌濤(1970-)，男，湖北省科技信息研究院助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)科技傳播。

R284.2

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1673-2197(2015)18-0015-02

10.11954/ytctyy.201518008