高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

嚴(yán) 芬，連燕萍，楊 光，王培松，吳晨爍，陳寧辛

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350116）

高產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

嚴(yán) 芬，連燕萍，楊 光，王培松，吳晨爍，陳寧辛

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350116）

采用透明圈初篩方法得到一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株B1，通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas sp.）。通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株B1產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基組成為：褐藻酸鈉1%，氯化銨0.2%，NaCl 3%，KH2PO40.02%，MgSO40.01%，CaCl2·2H2O 0.1%，初始pH5.5。最佳的培養(yǎng)條件：裝液量75 mL，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)22 h。在該條件下，褐藻膠裂解酶最高酶活力提高到71.94 U/mL，提高了72.11%。

褐藻膠裂解酶，假交替單胞菌，篩選，鑒定，培養(yǎng)條件

褐藻膠是來源于褐藻植物細(xì)胞壁的水溶性酸性多糖，具有良好的增稠乳化穩(wěn)定功能，其降解產(chǎn)物褐藻膠低聚糖具有特殊的化學(xué)特性和生物活性，在保健食品、新藥開發(fā)等方面也具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，例如促進(jìn)雙岐桿菌的生長、預(yù)防齲齒、作為藻酸雙脂和海立特等海洋藥物的原料基礎(chǔ)等[1-2]。目前褐藻膠的降解方法主要有酸降解、堿降解、酶法降解等[3]，其中酶法降解由于具有催化效率高、專一性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)代替化學(xué)降解已經(jīng)成為一種必然。褐藻膠裂解酶作為一種降解褐藻膠的酶，利用β-消除反應(yīng)切開褐藻膠分子中C4，C5之間的β-1，4-糖苷鍵，使其產(chǎn)生雙鍵并形成不飽和糖醛酸[4]。根據(jù)其對(duì)底物聚甘露糖醛酸（PM）和聚古洛糖酸酸（PG）的作用情況不同，褐藻膠裂解酶可分為三類：專一性裂解M片段的裂解酶、專一性裂解G片段的裂解酶和對(duì)兩種底物都能裂解的雙功能裂解酶[5]。因此對(duì)褐藻膠裂解酶的研究對(duì)于推動(dòng)褐藻低聚糖的進(jìn)一步開發(fā)有著深遠(yuǎn)的意義和應(yīng)用前景。褐藻膠裂解酶自身也具有重要的藥用價(jià)值，對(duì)綠膿桿菌的生物膜具有降解作用，是治療由綠膿桿菌感染引起的囊性纖維化病的輔療藥物[6-7]。

褐藻膠裂解酶具有廣泛的來源，如海藻類、海洋軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、海洋細(xì)菌、陸生真菌以及土壤細(xì)菌等[7]，微生物來源主要有假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）[8]、弧菌（Vibrio）[9]、黃桿菌（Flavobacterium）[10]、芽胞桿菌（Bacillus）[11]、鏈霉菌（Streptomyces）[12]。但大部分產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物生長條件較特殊，酶活力低，穩(wěn)定性差，不易分離[13]，本文從鮑魚內(nèi)臟篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的假交替單胞菌B1，該菌株具有較好的pH穩(wěn)定性，鑒于發(fā)酵條件對(duì)微生物產(chǎn)酶能力的影響，對(duì)菌株B1產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，以期提高其酶活力，為褐藻膠裂解酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶及鮑魚內(nèi)臟 寧德海域；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PCR引物 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；褐藻酸鈉等藥品 西隴化工股份有限公司。

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；752N型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī) 日本HITACHI公司；ECLIPSE E100型三目顯微鏡 日本尼康株式會(huì)社。

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：褐藻酸鈉10.0 g，蛋白胨2.0 g，人工海水1.0 L。pH7.0，121℃蒸汽滅菌30 min。

種子培養(yǎng)液：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，磷酸鐵0.01 g，人工海水 1.0 L。pH7.2，121℃蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)液：褐藻酸鈉5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO41.0 g，人工海水1.0 L。pH7.5，121℃蒸汽滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 將腐爛海帶、鮑魚內(nèi)臟取出均質(zhì)后稀釋涂布到篩選培養(yǎng)基進(jìn)行分離初篩，28℃、培養(yǎng)3～4 d，篩選出有降解圈或者凹陷明顯的菌落，進(jìn)一步分離純化，斜面保藏。將斜面培養(yǎng)基活化的菌體接種到種子液中，置于28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，以3%（v/v）的接種量接種于50 mL發(fā)酵液中，置于28℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每12 h取樣，于10000 r/min，離心5 min，取上清液，測(cè)定褐藻膠裂解酶的酶活力。

1.3.2 酶活力測(cè)定 采用DNS法測(cè)定酶活力[14]，取發(fā)酵液上清與0.75%（w/v）褐藻酸鈉底物反應(yīng)，以滅活的酶液與褐藻酸鈉底物混合液作為對(duì)照組，根據(jù)產(chǎn)生還原糖的情況判斷酶活力大小。酶活力單位定義為在40℃條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 菌株形態(tài)鑒定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]對(duì)分離篩選到的菌株B1進(jìn)行菌落特征和形態(tài)特征的鑒定。

1.3.3.2 16S rDNA鑒定 采用試劑盒提取細(xì)菌總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR mastermix 10 μL、DNA 1 μL、上下游引物各1 μL及ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收，并用DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，獲得的片段委托到上海英濰捷基公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到GenBank并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性分析，使用ClustalX軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的16S rDNA序列進(jìn)行多序列比較，Mega5.0[16]軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)過自舉分析Bootstrap檢測(cè)置信度，重復(fù)1000次，確定該菌的分類地位。

1.3.4 產(chǎn)酶條件研究 通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、NaCl濃度以及無機(jī)鹽種類。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，重復(fù)三次。

1.3.4.1 碳源及其添加量的研究 分別以0.5%（w/v）的蔗糖、淀粉、甘油、褐藻酸鈉、甘露糖作為碳源，并加入0.2%（w/v）蛋白胨，0.1%（w/v）KH2PO4配制發(fā)酵培養(yǎng)基，pH7.5，以3%（v/v）的接種量接種于50 mL發(fā)酵液中，置于28℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，研究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。在確定最佳碳源后，改變其濃度，在相同條件下研究碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.2 氮源及其添加量的研究 在最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別添加0.5%（w/v）酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨與牛肉膏作為氮源，并加入0.1%（w/v）KH2PO4配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件與1.3.4.1相同，研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。在確定最佳氮源后，改變其濃度，在相同條件下研究氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.3 NaCl濃度的研究 確定最佳碳源及氮源基礎(chǔ)上，添加1%、2%、3%、4%、5%（w/v）的NaCl，并加入0.1%（w/v）KH2PO4配制培養(yǎng)基，其他條件與1.3.4.1相同，研究NaCl濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.4 無機(jī)鹽種類的研究 在最佳碳源、氮源及NaCl基礎(chǔ)上，添加KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O，其他條件與1.3.4.1相同，考察無機(jī)鹽對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.5 培養(yǎng)基初始pH的研究 培養(yǎng)基成分及其他培養(yǎng)條件不變，改變培養(yǎng)基初始pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，研究培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.6 裝液量的研究 培養(yǎng)基成分及其他培養(yǎng)條件不變，在250 mL三角瓶中分別加入25、50、75、100、125 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，研究裝液量對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.7 搖床轉(zhuǎn)速的研究 培養(yǎng)基成分及其他培養(yǎng)條件不變，只改變轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200 r/min對(duì)菌株B1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究轉(zhuǎn)速對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.8 發(fā)酵溫度的研究 培養(yǎng)基成分及其他培養(yǎng)條件不變，分別在25、28、30、33、35℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌株B1，確定其最適發(fā)酵溫度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS.20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并檢驗(yàn)各因素的差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

經(jīng)過篩選培養(yǎng)基初篩獲得9株在初篩培養(yǎng)基上出現(xiàn)凹陷或透明圈現(xiàn)象的菌株，分別命名為B1～B9。經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定其酶活力如圖1所示，結(jié)果表明菌株B1相對(duì)其他菌株具有較高的酶活力，培養(yǎng)28 h后酶活力達(dá)到41.8 U/mL，最終以B1為實(shí)驗(yàn)菌株做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同菌株的酶活力Fig.1 Alginate lyase activities of different strains

2.2 菌株B1的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 菌株B1菌落形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)特征如圖2所示。由圖2（a）可知，菌株B1單菌落較為濕潤，呈圓形，中間凸起，表面光滑，乳白色，不透明，邊緣光滑，易挑??；由圖2（b）可知，菌體細(xì)胞呈短棒桿狀，未發(fā)現(xiàn)芽孢存在。

圖2 菌株B1的菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察（1000×）Fig.2 Colony and cellular morphology of strain B1（1000×）

2.2.2 16S rDNA序列分析 利用16S rDNA通用引物對(duì)菌株B1菌株擴(kuò)增，得到1499 bp的目的片段。將獲得序列提交至GeneBank（登錄號(hào)：KM277582）并在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，結(jié)果顯示菌株B1與假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.QY202等）同源性高達(dá)99%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示，菌株B1與假交替單胞菌屬在親緣關(guān)系上最接近，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，鑒定菌株B1為假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.）。

圖3 基于16S rDNA構(gòu)建菌株B1的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B1 based on 16S rDNA

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源種類及其添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖4可知，以褐藻酸鈉為碳源時(shí)，菌株的產(chǎn)酶效果最好，而以甘露聚糖、蔗糖、淀粉為碳源時(shí)，菌株產(chǎn)酶量極低，故確定褐藻酸鈉為最佳碳源。改變發(fā)酵培養(yǎng)基中褐藻酸鈉的濃度對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示。褐藻酸鈉濃度在0.2%～0.6%時(shí)，菌株B1產(chǎn)酶能力緩慢增長；當(dāng)大于0.6%后呈快速增長趨勢(shì)，并在濃度為1.0%時(shí)達(dá)到最大，而后呈下降趨勢(shì)。這主要是由于高濃度的褐藻酸鈉增加了培養(yǎng)基的粘度影響溶氧，不利于菌株產(chǎn)酶。因此選擇濃度1.0%的褐藻酸鈉作為菌株B1的最佳碳源濃度。

圖4 不同碳源對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on enzyme production by strains B1

圖5 褐藻酸鈉濃度對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of the concemtration of alginate on enzyme production by strain B1

2.3.2 氮源種類及其添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，菌株B1可以利用多種氮源進(jìn)行自身的生長及產(chǎn)酶，但利用程度不同。其中以氯化銨為氮源時(shí)，菌株的產(chǎn)酶效果最佳。文獻(xiàn)報(bào)道，大西洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）AR06產(chǎn)酶的最適氮源為硝酸氨[17]，而中華黃海桿菌（Gilvimarinus chinensis）QM42產(chǎn)酶的最適氮源為蛋白胨[18]，這說明不同菌屬產(chǎn)酶所利用的最佳氮源種類差別較大。進(jìn)一步考察不同濃度的氯化銨對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7所示。氯化銨濃度為0.2%時(shí)，菌株B1產(chǎn)酶效果最佳，因此確定氯化銨的最適濃度為0.2%。

2.3.3 NaCl濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 海洋來源的褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌株，需要一定的鹽度才能生長代謝和產(chǎn)酶。NaCl濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響結(jié)果如圖8所示。NaCl濃度小于3%時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力隨著濃度增加而增加；當(dāng)NaCl濃度為3%時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力最大；當(dāng)大于3%時(shí)，菌株產(chǎn)酶逐漸趨于平穩(wěn)，故選取濃度為3%的NaCl作為最佳的鹽濃度。HU等報(bào)道的Vibrio sp.510-64產(chǎn)酶的最適鹽度也是3%[19]。

圖6 不同氮源對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on enzyme production by strain B1

圖7 氯化銨濃度對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of ammonium concentration on enzyme production by strain B1

圖8 NaCl濃度對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on enzyme production by strain B1

2.3.4 無機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 無機(jī)鹽對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響結(jié)果見表1。單一無機(jī)鹽KH2PO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最為明顯，MgSO4和CaCl2·2H2O（0.1%）對(duì)菌株產(chǎn)酶也起到了促進(jìn)作用。進(jìn)一步對(duì)有促進(jìn)作用的無機(jī)鹽進(jìn)行組合，結(jié)果顯示添加KH2PO4（0.02%）＋MgSO4（0.01%）＋CaCl2·2H2O（0.1%）的無機(jī)鹽組合時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力最大。Ca2＋對(duì)Pseudoalteromonas LJ1菌株產(chǎn)酶起著一定的促進(jìn)作用[9]，而對(duì)Acinetobacter X8產(chǎn)酶則起著抑制作用[8]，表明無機(jī)鹽對(duì)不同菌屬的產(chǎn)酶能力影響不同。

表1 無機(jī)鹽對(duì)菌株B1產(chǎn)褐藻膠裂解酶的影響Table 1 Effect of inorganic salts on alginate lyase activity by strain B1

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基的初始pH會(huì)影響菌株細(xì)胞膜的通透性從而影響其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因此初始pH對(duì)菌株的生長及產(chǎn)酶有一定的影響。本文研究培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖9所示。在pH5～5.5范圍內(nèi)，褐藻膠裂解酶酶活力隨著pH的上升而增大；當(dāng)pH達(dá)到5.5時(shí)，酶活力達(dá)到最大；在pH5.5～7.5范圍內(nèi)，酶活力呈緩慢下降趨勢(shì)；當(dāng)pH超過7.5后，酶活力迅速下降。由此表明，微酸環(huán)境有利菌株B1產(chǎn)酶，這與Vibrio sp. QY103[20]產(chǎn)酶的最適初始pH相同，但大多數(shù)菌株產(chǎn)酶最適初始pH都在中性偏堿性環(huán)境即pH6～8[13，21-22]之間。

圖9 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of initial pH of the medium on enzyme production by strain B1

2.4.2 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 裝液量對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖10所示。裝液量從25～75 mL時(shí)，褐藻膠裂解酶酶活力隨之緩慢上升；裝液量為75 mL時(shí)，酶活力最高；當(dāng)裝液量繼續(xù)增加后，酶活力快速下降。這主要是由于過低的裝液量在搖瓶過程中水分蒸發(fā)過快不利于菌株產(chǎn)酶，而裝液量過大易導(dǎo)致溶氧降低也不利于菌株的生長及產(chǎn)酶，因此裝液量選取75 mL為最適裝液量。

圖10 裝液量對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of medium volume on enzyme production by strain B1

2.4.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株B1產(chǎn)酶影響結(jié)果如圖11所示。當(dāng)轉(zhuǎn)速在120～180 r/min之間，B1菌株產(chǎn)酶能力隨著轉(zhuǎn)速增大而上升，并在180 r/min時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)轉(zhuǎn)速超過180 r/min后，菌株產(chǎn)酶能力迅速下降。這主要是由于轉(zhuǎn)速過低會(huì)影響菌株的呼吸從而造成代謝異常，而轉(zhuǎn)速過高則會(huì)加大搖瓶內(nèi)的剪切力，造成細(xì)胞損傷而使菌體提前自溶，因此選取180 r/min為最適轉(zhuǎn)速。

圖11 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of rotating rate on enzyme production by strain B1

2.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響 菌株的生長代謝與溫度密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖12）表明，當(dāng)溫度在25～30℃時(shí)，酶活力呈迅速增長趨勢(shì)；當(dāng)溫度為30℃時(shí)，酶活力到達(dá)最高值；當(dāng)溫度超過30℃時(shí)，酶活力迅速下降。因此選取30℃為最適發(fā)酵溫度，這與已報(bào)道的海洋細(xì)菌的生長溫度范圍（25～30℃）相符合。

圖12 溫度對(duì)菌株B1產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effect of temperature on enzyme production by strain B1

2.5 優(yōu)化前后產(chǎn)酶曲線

對(duì)菌株B1發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化前后的產(chǎn)酶曲線進(jìn)行比較，結(jié)果如圖13所示。優(yōu)化后，褐藻膠裂解酶的合成周期大大提前，在發(fā)酵22 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大值（71.94 U/mL），24 h后呈緩慢下降趨勢(shì)。與優(yōu)化前相比，產(chǎn)酶高峰的時(shí)間由28 h縮短到22 h，最高酶活力由41.8 U/mL上升到71.94 U/mL，提高了72.11%。

圖13 菌株B1的產(chǎn)酶曲線Fig.13 Time course of enzyme formation of strain B1

3 結(jié)論

以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，從海帶、鮑魚內(nèi)臟中篩選到9株產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株，發(fā)酵復(fù)篩得到產(chǎn)酶活力最高的菌株B1。通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析鑒定菌株B1為假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）。菌株B1最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基：1%褐藻酸鈉，0.2%氯化銨，3%NaCl，0.02%KH2PO4，0.01%MgSO4，0.1%CaCl2·2H2O，初始pH5.5。最佳的發(fā)酵條件：裝液量75 mL，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min。在上述優(yōu)化條件下發(fā)酵，褐藻膠裂解酶活力可達(dá)71.94 U/mL，提高了72.11%，發(fā)酵周期由28 h縮短至22 h。本文對(duì)產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株進(jìn)行篩選鑒定，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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Screening of alginate lyase-producing strains and optimization of fermentation conditions

YAN Fen，LIAN Yan-ping，YANG Guang，WANG Pei-song，WU Chen-shuo，CHEN Ning-xin
（College of Biological Science and Engineering，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350116，China）

A bacterial alginate lyase-producing strain B1 was screened with transparent circle method，It was identified as Pseudoalteromonas sp.according to its morphological observation and 16S rDNA sequence analysis to identified strain B1．And by single-factor method to optimize its enzyme production conditions，the optimal medium component were，sodium alginate 1%，NH4Cl 0.2%，NaCl 3%，KH2PO40.02%，MgSO40.01%，CaCl2·2H2O 0.1%，initial pH5.5，the optimal culture conditions were as follows：75 mL medium in 250 mL Erlenmeyer flask，Cultured at 30℃，shaking speed of 180 r/min，for 22 h．Under the optimal culture conditions，the highest enzyme activity of alginate lyase was up to 71.94 U/mL，improving 72.11%．

alginate lyase；Pseudoalteromonas；screen；identify；culture conditions

TS201.3

A

1002-0306（2015）22-0287-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.051

2015－03－04

嚴(yán)芬（1980-），女，博士，講師，研究方向：食品微生物，E-mail：yanfen@fzu.edu.cn。

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目（201305015）。