細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)膀胱癌化療耐藥的研究

潘春武 王偉明 劉建河 康健 劉海龍 齊雋 沈周俊

肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后有著很高的復(fù)發(fā)率，部分原因是因?yàn)榘螂装┯卸嗌l(fā)中心的特點(diǎn)，但另一個(gè)重要原因是腫瘤對(duì)術(shù)后的膀胱灌注化療不敏感。以往對(duì)腫瘤化療耐藥的研究主要集中于腫瘤細(xì)胞本身，而對(duì)腫瘤微環(huán)境所扮演的角色關(guān)注甚少。近年來(lái)，腫瘤所處的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）介導(dǎo)的化療耐藥（cell adhesion mediated drug resistance，CAMDR）概念的提出是化療耐藥領(lǐng)域重要進(jìn)展之一［1－2］。膀胱癌中是否也存在CAM－DR及其機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)ECM中的主要成分纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）與膀胱癌細(xì)胞黏附后，細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡及細(xì)胞周期改變，以及涉及的信號(hào)通路，探討膀胱癌中可能出現(xiàn)的CAM－DR及分子機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

T24人膀胱癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院，在含10%的胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

二、藥物處理

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞接種在6孔板中，分為4組（組A～D），每組3個(gè)復(fù)孔。除組A為對(duì)照組外，組B～D均用100μg／ml的絲裂霉素C（MMC，美國(guó)Calbiochem公司）處理。組C和D孔板底部預(yù)先用2μg／cm2的FN（美國(guó)GIBCO公司）4℃包被過(guò)夜。組D細(xì)胞在接受MMC處理前先用磷 脂 酰 肌 醇 3－激 酶 （PI3－K）特 異 性 抑 制 劑LY294002（50μmol／L，美國(guó)Calbiochem公司）預(yù)處理1h。

三、凋亡檢測(cè)

Vybrant凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó) Molecular Probes公司）用于細(xì)胞凋亡染色，該試劑盒包含Alexa Fluor 488Annexin V和100μg／ml的PI溶液。染色的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀（FCM，BD FACSCalibur System）和共聚焦顯微鏡（CLSM，Zeiss LSM510）檢測(cè)。

四、細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞用63%乙醇4℃固定24h，冰PBS洗2次，PI／Triton X－100 染 色 液 （Sigma 公 司 ）避 光37℃染色15min，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

五、比色法檢測(cè)Caspase激活

Caspase－8和Caspase－9比色法檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Chemicon公司）用于檢測(cè)Caspase－8和Caspase－9的激活。細(xì)胞經(jīng)MMC分別處理0、6、12、24h后，裂解離心提取上清，利用上述試劑盒通過(guò)分光光度計(jì)（Anthos Zenyth 1100Spectrophotometer）分別讀取吸光度，計(jì)算Caspase－8和Caspase－9的激活情況。

六、免疫熒光

生長(zhǎng)在蓋玻片上的T24細(xì)胞予以4%多聚甲醛固定，0.2% （v／v）Triton X－100打孔，5%的牛血清蛋白（BSA）4℃封閉1h，抗凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）抗體（1∶100，美國(guó)Santa Cruz公司）4℃孵育過(guò)夜，Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗（1∶400，美國(guó)Molecular Probes公司）4℃孵育1h。PI（1μg／ml，美國(guó)Molecular Probes公司）4℃避光染色15min。CLSM檢測(cè)AIF核分布情況。

七、胞質(zhì)蛋白及核蛋白提取

細(xì)胞質(zhì)蛋白及核蛋白提取使用NucBuster Protein Extraction試劑盒（美國(guó)Novagen公司），嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

八、蛋白印跡法

收集細(xì)胞裂解后，高速離心提取蛋白，SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA常溫封閉2h后與一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后，與相應(yīng)二抗常溫孵育1h。TBST洗膜3次后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物（ECL，美國(guó)Millipore公司）顯影。本研究采用的一抗包括抗AIF抗體（1∶200，Santa Cruz）、抗 Histone 1 抗 體 （1∶200，Santa Cruz）、抗 GSK－3β抗體（1∶1 000，Cell Signaling）、抗Phospho－GSK－3β－Ser9抗體（1∶1 000，Cell Signaling）、抗 Cyclin D1抗體（1∶2 000，Cell Signaling）、抗β－Tubulin抗體（1∶1 000，Sigma）、抗 β1－integrin抗體（1∶1 000，Cell Signaling）、抗 PI3－K抗體 （1∶1 000，Cell Signaling）、抗 Akt抗 體（1∶100，Cell Signaling）、抗 Phospho－Akt－Ser473抗體（1∶1 000，Cell Signaling）、抗β－Actin抗體（1∶10 000，Sigma）等。二抗包括 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（1∶10 000，Pierce）和 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶10 000，Pierce）。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5軟件系統(tǒng)，多組計(jì)量指標(biāo)比較采用多因素方差分析（ANOVA）。顯著性水平α設(shè)為0.05。

結(jié) 果

一、FN拮抗了MMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡

MMC（100μg／ml）處理24h后，T24細(xì)胞予以Annexin V／PI雙染后用CLSM及FCM分別檢測(cè)。CLSM結(jié)果如圖1A所示，MMC處理24h后，T24細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，但與FN黏附的細(xì)胞凋亡受到顯著抑制，而預(yù)處理LY294002則明顯對(duì)抗了上述FN的作用。FCM結(jié)果與CLSM一致，見(jiàn)圖1B。

圖1 FN拮抗了MMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡

二、FN 抑制了 Caspase－9而非 Caspase－8凋亡途徑的激活

我們研究了FN對(duì)兩條經(jīng)典凋亡途徑Caspase－8和 Caspase－9的作 用。如圖2A 所示，MMC（100μg／ml）處理6、12、24h，Caspase－8有輕度激活，但組B、C、D間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相反，Caspase－9在組B、D顯著升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但組C無(wú)明顯激活，與組B、D比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、FN抑制了MMC誘導(dǎo)的AIF凋亡通路的激活

AIF是一條獨(dú)立于Caspase途徑的凋亡通路，當(dāng)AIF轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)即可直接引起細(xì)胞凋亡［3］。首先我們通過(guò)免疫熒光觀察了各組細(xì)胞AIF核轉(zhuǎn)位情況，如圖2B所示，MMC處理后出現(xiàn)明顯的AIF核轉(zhuǎn)位，但與FN黏附后AIF核轉(zhuǎn)位被抑制，而以LY294002預(yù)處理后的細(xì)胞仍然出現(xiàn)明顯的AIF核轉(zhuǎn)位。我們接著分離了各組細(xì)胞MMC處理后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胞質(zhì)蛋白與核蛋白，行蛋白印跡法檢測(cè)。如圖2C所示，組B細(xì)胞經(jīng)MMC處理后6、12h，核內(nèi)AIF表達(dá)顯著增加，而組C細(xì)胞與FN黏附后，核內(nèi)AIF表達(dá)無(wú)明顯升高，組D細(xì)胞經(jīng)LY294002預(yù)處理，核內(nèi)AIF表達(dá)升高明顯。各組細(xì)胞胞質(zhì)AIF表達(dá)水平無(wú)明顯變化。

圖2 FN通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase－9和AIF而非Caspase－8凋亡途徑對(duì)抗MMC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

四、FN拮抗了MMC誘導(dǎo)的G1／S期停滯

我們通過(guò)FCM檢測(cè)了細(xì)胞周期變化情況。如圖3A所示，組B細(xì)胞經(jīng) MMC（100μg／ml）處理24h后，G0／G1期細(xì)胞出現(xiàn)明顯累積，提示 MMC誘導(dǎo)了T24細(xì)胞G1／S期停滯。組C細(xì)胞與FN黏附后，G0／G1期細(xì)胞較組B細(xì)胞明顯減少，提示MMC誘導(dǎo)的G1／S期停滯被FN拮抗，而組D細(xì)胞預(yù)處理LY294002后，F(xiàn)N的上述作用消失。

五、FN 通過(guò) GSK－3β／Cyclin D1調(diào)控細(xì)胞周期改變

Cyclin D1是細(xì)胞G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而Cyclin D1受 GSK－3β調(diào)節(jié)［4］。因此，我們檢測(cè)了各組細(xì)胞 GSK－3β、p－GSK－3β、Cyclin D1的表達(dá)水平。如圖3B所示，F(xiàn)N黏附后上調(diào)了p－GSK－3β水平進(jìn)而穩(wěn)定了Cyclin D1的表達(dá)，從而促使細(xì)胞進(jìn)入S期，該作用可以被LY294002所拮抗。

圖3 FN通過(guò)調(diào)控GSK－3β／Cyclin D1拮抗了MMC誘導(dǎo)的G1／S期停滯

六、FN介導(dǎo)的MMC耐藥是PI3－K／Akt依賴的

T24細(xì)胞經(jīng) MMC（100μg／ml）處理24h后，蛋白印跡法檢測(cè)β1－integrin、PI3－K、p－Akt、Akt，結(jié)果如圖4A、B所示。FN與T24細(xì)胞黏附后，上調(diào)了PI3－K表達(dá)水平，進(jìn)而磷酸化激活A(yù)kt。LY294002作為PI3－K特異性抑制劑，可以完全阻斷FN誘導(dǎo)的PI3－K／Akt激活。β1－integrin，作為 FN 與細(xì)胞黏附的膜受體，其表達(dá)水平不受FN、MMC、LY294002影響。

圖4 FN介導(dǎo)的MMC耐藥是PI3－K／Akt依賴的

討 論

ECM蛋白保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物殺傷導(dǎo)致CAM－DR 已在 多 種 腫 瘤中 發(fā) 現(xiàn)［1－2］，然而 ECM在膀胱癌化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究證實(shí)，F(xiàn)N（一種ECM中的主要蛋白）與膀胱癌細(xì)胞黏附后顯著抑制了MMC誘導(dǎo)的凋亡，這提示FN介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞保護(hù)作用在膀胱癌化療耐藥中起重要作用，也提示CAM－DR是一種在惡性腫瘤中廣泛存在的現(xiàn)象。

目前認(rèn)為存在兩種Caspase依賴的經(jīng)典凋亡途徑：Caspases－8和 Caspases－9途徑，Caspase－3是它們共同的執(zhí)行Caspase。在小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，ECM通過(guò)抑制Caspase－3激活從而對(duì)抗化療藥物的殺傷，但未明確作用于哪條Caspase途徑［5］。Estrugo等［6］在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，ECM蛋白通過(guò)抑制Caspases－8的激活導(dǎo)致腫瘤對(duì)阿糖胞苷及放療的耐受。本研究發(fā)現(xiàn)FN與T24細(xì)胞黏附后顯著抑制了 MMC激活的Caspase－9途徑而非Caspase－8途徑。

AIF是一條Caspase非依賴的凋亡途徑，其從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)后可以直接引起DNA降解［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，MMC可以誘導(dǎo)AIF入核，但FN可以顯著抑制該過(guò)程。值得注意的是，Caspase－9和AIF都是線粒體功能紊亂所誘發(fā)的下游分子，因此，我們認(rèn)為FN與T24細(xì)胞黏附后主要通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體途徑來(lái)抑制MMC誘導(dǎo)的凋亡。必須注意的是，本研究只使用了一種化療藥物作為研究工具，不同的化療藥物可能會(huì)有不同的凋亡途徑，進(jìn)一步的研究可以采用多種化療藥物及多種膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行更全面的研究。

影響腫瘤細(xì)胞周期的因素是引起耐藥的另一個(gè)重要方面。有研究發(fā)現(xiàn)G1或G2期的周期停滯在CAM－DR中發(fā)揮重要作用［7－8］。本研究發(fā)現(xiàn) FN 與T24細(xì)胞黏附后拮抗了 MMC誘導(dǎo)的G1／S期停滯。Cyclin D1誘導(dǎo)的有絲分裂是G1期向S期轉(zhuǎn)換的重要事件，隨著G1／S期轉(zhuǎn)換的完成，GSK－3β表達(dá)增加導(dǎo)致Cyclin D1失活［4］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)N 上調(diào)了p－GSK－3β水平導(dǎo)致 GSK－3β失活，從而穩(wěn)定了Cyclin D1表達(dá)，最終促使腫瘤細(xì)胞跨越G0／G1停滯繼續(xù)分裂增殖。因此，F(xiàn)N對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控也在T24細(xì)胞的CAM－DR中發(fā)揮重要作用。

以往的研究證實(shí)，ECM與細(xì)胞黏附后通過(guò)激活PI3－K／Akt信號(hào)通路從而抑制腫瘤細(xì)胞死亡［5，9］。Akt通常被Class 1A或Class 1B的PI3－K激活，但也有文獻(xiàn)報(bào)道其可以PI3－K非依賴的形式激活［10－11］。本研究中，F(xiàn)N 上調(diào)了 PI3－K 及 p－Akt水平，且 Akt的 激 活 可 以 被 PI3－K 的 阻 滯 劑LY294002完全阻斷。因此，在T24細(xì)胞中，F(xiàn)N對(duì)Akt信號(hào)的激活是PI3－K依賴的。Akt信號(hào)通路是目前認(rèn)識(shí)到的最重要的促腫瘤信號(hào)通路。Akt可以磷酸化抑制BAD，也可以直接減弱Caspase－9的激活從而抑制凋亡［12－13］。Akt的另一個(gè)功能是抑制GSK－3的激活［14］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在膀胱癌細(xì)胞中，F(xiàn)N介導(dǎo)的對(duì)Caspase－9及GSK－3β的抑制作用可以被LY294002所取消，因此FN的上述作用是PI3－K／Akt所依賴的。

總之，本研究表明，F(xiàn)N介導(dǎo)的PI3－K／Akt信號(hào)通路激活從而保護(hù)了膀胱癌細(xì)胞免受MMC的殺傷，該作用是通過(guò)抑制Caspase－9和AIF凋亡途徑以及通過(guò) GSK－3β／Cyclin D1通路促進(jìn)了 G1／S的轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的。基于以上機(jī)制的闡明，阻斷FN激活的信號(hào)通路可能是提高膀胱癌化療效果的新策略。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究正在進(jìn)行中。

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