表皮生長因子受體基因在非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變情況分析及臨床意義

卿松 劉銘 師藝 王玻瑋 馬遇慶

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，新疆烏魯木齊830054

表皮生長因子受體基因在非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變情況分析及臨床意義

卿松 劉銘 師藝 王?，| 馬遇慶▲

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，新疆烏魯木齊830054

目的探討表皮生長因子受體（EGFR）基因在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變情況，分析其在不同病灶中的突變率與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的TaqMan探針法檢測50例NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因突變情況，并通過統(tǒng)計(jì)軟件分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果50例NSCLC原發(fā)灶中，EGFR基因突變率為38.0%（19/50），與性別、病理組織學(xué)類型、吸煙關(guān)系密切（P＜0.05），與年齡、分化程度、部位、民族、臨床分期無關(guān)（P＞0.05）；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變率為22.0%（11/50），與原發(fā)灶EGFR基因突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與其他臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論EGFR基因突變主要集中于女性、肺腺癌、非吸煙患者，并且在NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中突變不一致，表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性，影響療效。

表皮生長因子受體；非小細(xì)胞肺癌；原發(fā)灶；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)

肺癌以其高發(fā)病率和病死率位居各種常見惡性腫瘤的第一位，全球每年新增患者為160萬例，而死亡患者高達(dá)138萬例[1-2]。我國每年新增肺癌患者70余萬人，其中70%～80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），2/3的患者初診時已為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會[3]，而采用傳統(tǒng)含鉑雙藥化療預(yù)后不佳。隨著Lynch等[4]和Paez等[5]首次報道了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變可進(jìn)行藥物靶向治療后，NSCLC進(jìn)入了分子靶向的個性化治療時代，中晚期患者的預(yù)后明顯改善，但由于腫瘤的異質(zhì)性，患者療效不盡相同。本研究檢測EGFR基因在NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變情況，分析其突變與臨床病理特征的關(guān)系，輔助臨床的后續(xù)靶向治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年4月～2014年12月經(jīng)病理檢查確診為NSCLC的50例病例的存檔切片、蠟塊及相關(guān)臨床資料，并且每例病例均包括腫瘤原發(fā)灶及配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。50例病例中女19例，男31例；年齡35～78歲，平均（61.3± 10.7）歲；其中≤60歲有20例，＞60歲有30例；NSCLC病理學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌14例，腺癌36例；腫瘤分化程度：高中分化33例，低分化17例；臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期17例，腫瘤部位：左葉21例，右葉29例；民族：維吾爾族患者3例，漢族患者47例；19例采用靶向藥物治療，31例采用傳統(tǒng)藥物治療；有吸煙史的患者30例（＞5支/d）；隨訪時間截至2015年1月，共有21例健在，25例死亡，4例失訪。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，臨床資料及石蠟標(biāo)本均獲患者同意后使用。

1.2 主要儀器及試劑

ABI-7500定量PCR儀（美國ABI公司），NanoDrop-2000超微量分光光度計(jì)（美國NanoDrop公司）；石蠟組織DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit，德國QIAGEN公司），人EGFR基因突變檢測試劑盒（熒光PCR）（中國北京雅康博生物科技有限公司）。

1.3 石蠟DNA提取及濃度測定

按照QIAamp DNA Mini Kit操作步驟：常規(guī)切片4 μm厚10張，脫蠟、水化、烘干，加入裂解液、蛋白酶K后55℃水浴箱過夜，離心后取上清液。使用Nano-Drop-2000測定波長260/280 nm處的吸光度（A）值，確定DNA的純度和濃度。

1.4 實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

采用RT-PCR的TaqMan探針法檢測NSCLC中EGFR基因18、19、20、21外顯子特定區(qū)域突變型基因。按照人EGFR基因突變檢測試劑盒（熒光PCR）的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL∶3.0 μL TaqMan Universal Master Mix 2X，3.0 μL DNA模板，19 μL檢測試劑Ⅰ。反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)10 min（1個循環(huán)）；95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)60 s，以上2個步驟進(jìn)行40個循環(huán)。每次試驗(yàn)均設(shè)定陰性、陽性對照及空白對照。根據(jù)樣本擴(kuò)增曲線及相應(yīng)Ct值，檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct值=0的樣本為陰性樣本，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct值＜34.0的樣本為陽性樣本，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且34.0≤Ct值≤38.0的樣本重做，若重做結(jié)果與原結(jié)果近似則判定為陰性樣本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。EGFR基因在各組間的突變率及與臨床病理特征相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，單因素生存分析采用乘積極限法（Kaplan-Meier），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因突變情況分析

本研究采用RT-PCR的TaqMan探針法對50例NSCLC的原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示EGFR基因在NSCLC原發(fā)灶中總突變率為38.0%（19/50），其中第19號外顯子突變率為22.0%（11/50），均為缺失突變，第21號外顯子突變率為16.0%（8/50），均為L858R突變。在NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中總突變率為22.0%（11/50），其中第19號外顯子突變率為8.0%（4/50），均為缺失突變，第21號外顯子突變率為14.0%（7/50），均為L858R突變。EGFR基因在NSCLC原發(fā)灶的突變率要高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的突變率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）。見表1。

表1 EGFR基因突變在NSCLC原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間的比較（例）

2.2 NSCLC原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因突變情況與臨床病理特征之間的關(guān)系

NSCLC原發(fā)灶中，EGFR基因在女性中的突變率要高于男性，在腺癌中的突變率高于鱗狀細(xì)胞癌，同時，EGFR基因在不吸煙患者中的突變率高于吸煙患者，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、分化程度、部位、臨床分期、民族無關(guān)（P＞0.05）。EGFR基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變率與性別、年齡、組織學(xué)類型、分化程度、部位、臨床分期、民族均無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3 靶向藥物治療及傳統(tǒng)藥物治療與患者預(yù)后關(guān)系

原發(fā)灶中19例EGFR基因突變患者均采用靶向藥物（吉非替尼或厄洛替尼）治療，31例未突變的患者均采用傳統(tǒng)治療，靶向藥物治療組的平均生存期為（16.0±4.9）個月，傳統(tǒng)藥物治療組平均生存時間為（10.0±4.1）個月。通過Kaplan-Meier法比較兩組患者的生存期，發(fā)現(xiàn)靶向藥物治療組患者的生存時間明顯高于傳統(tǒng)藥物治療組的生存時間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.570，P=0.018）（圖1）。而11例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變患者中有10例采用了靶向藥物治療，其生存時間與31例傳統(tǒng)藥物治療生存時間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.015，P=0.083）。

表2 EGFR基因在NSCLC原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變情況與臨床病理特征之間的關(guān)系（例）

圖1 非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶中靶向及傳統(tǒng)藥物治療與患者生存曲線

3 討論

EGFR在正常肺組織內(nèi)表達(dá)率很低，但在53%～70%的NSCLC中呈陽性表達(dá)[6]，其為酪氨酸激酶受體，分子量為170 000 D，位于染色體7q12上[7]，突變主要發(fā)生在編碼激酶區(qū)域的外顯子（18～21號外顯子）上[8]，EGFR基因突變被認(rèn)為是應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epider-mal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療中晚期NSCLC患者的前提條件，目前使用最多的一線藥物有吉非替尼、厄洛替尼等。隨著靶向藥物的使用，使中晚期NSCLC患者的中位生存期由原來傳統(tǒng)藥物治療的8～11個月延長到18～30個月[9-11]，預(yù)后得以改善。

本研究采用RT-PCR的TaqMan探針法對伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的50例NSCLC病例的原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶分別行EGFR基因檢測，結(jié)果顯示原發(fā)灶中EGFR基因突變率為38.0%，此結(jié)果與之前研究報道[12]EGFR基因在亞洲人群中的突變率38.1%～59.0%接近，并與國內(nèi)林芳等[13]、張怡浞等[14]研究中EGFR基因的突變率相似。徐慧英等[15]、謝靜等[16]研究中EGFR基因突變主要集中在19號外顯子缺失突變及21號外顯子的L858R突變，本研究中NSCLC原發(fā)灶的19例和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的11例EGFR基因突變類型均為19號外顯子缺失及21號外顯子的L858R突變，與上述研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示原發(fā)灶中EGFR基因在女性中的突變率要明顯高于男性，與趙瑾等[17]結(jié)果類似，并且EGFR基因的突變率在非吸煙患者中明顯高于吸煙患者，差異顯著。此前，Sun等[12]也報道在亞洲非吸煙女性的EGFR基因突變率要高于其他患者，說明性別和吸煙史對EGFR基因突變有著重要影響，但考慮到亞洲地區(qū)女性吸煙率遠(yuǎn)低于男性，張怡浞等[14]通過多因素分析顯示吸煙是EGFR基因突變的主要影響因素，而性別不是其影響因素。本組研究同樣顯示出EGFR基因突變率跟NSCLC病理組織學(xué)分型密切相關(guān)，在肺腺癌中的突變率明顯高于肺鱗狀細(xì)胞癌，與之前報道相符[9,12,15]。Kawaguchi等[18]研究發(fā)現(xiàn)EGFR在不同種族的突變率有差異，在亞裔患者的突變率約為30.0%，而高加索裔患者僅為10.0%。申紅麗等[19]對新疆維吾爾族及漢族患者的EGFR基因突變率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新疆維吾爾族患者的突變率為10.8%，漢族患者的突變率為44.2%，由于新疆維吾爾族與高加索人種接近，故在上述兩項(xiàng)研究中突變率接近，同時漢族與維吾爾族患者的突變率有顯著性差異。但在本研究中EGFR基因在維吾爾族患者中未突變，在漢族中的突變率（38.0%）低于申紅麗等[19]的研究，而且漢族與維吾爾族患者的突變率無差異，主要原因與本研究組的研究對象相對較少且維吾爾族患者過少有關(guān)，有待增加觀察對象及少數(shù)民族患者后進(jìn)一步研究。

本研究中，EGFR基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中有11例突變陽性，突變率為22.0%，低于原發(fā)灶中的突變率（38.0%），差異有顯著性，表明在本研究中EGFR基因的突變主要發(fā)生在原發(fā)灶。但目前關(guān)于EGFR基因在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中突變的研究結(jié)果不盡相同，如在Chang等[20]的研究中，EGFR基因在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變率分別為28.6%及33.9%，王帥等[21]研究中在原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶的突變率分別為38.7%及35.5%，均存在差異，但差異不明顯。而冷再君等[22]研究中轉(zhuǎn)移灶的突變率（58.6%）較原發(fā)灶（35.6%）高，有顯著性差異，與本研究結(jié)果相反，產(chǎn)生此類現(xiàn)象的原因估計(jì)與研究對象的數(shù)量及選取標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中突變的EGFR基因存在不一致現(xiàn)象，有10例在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中突變的EGFR基因保持一致，但有9例原發(fā)灶EGFR基因突變陽性而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中丟失，另有1例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR基因突變陽性但在原發(fā)灶中呈野生型，與之前報道類似[14,20-22]。這種現(xiàn)象表明在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞通過克隆演進(jìn)而獲得了不同的表型，顯示出腫瘤的異質(zhì)性，并對同一種靶向藥物有不同的反應(yīng)，影響療效。就如本組患者所表現(xiàn)出的，雖然靶向藥物治療可明顯延長患者的生存時間，但分別分析靶向藥物對原發(fā)病灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的療效后發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)灶中靶向藥物的治療對延長生存時間起著顯著作用，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中所起的作用就沒有那么明顯，兩者療效上的差異為腫瘤異質(zhì)性的體現(xiàn)，具體可表現(xiàn)在患者生存時間上，本研究中靶向藥物治療患者的平均生存時間為（16.0±4.9）個月，低于文獻(xiàn)[9-11]中的18～30個月，與本組患者均伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、存在腫瘤異質(zhì)性而影響療效有關(guān)，在傳統(tǒng)治療組中由于其藥物作用機(jī)制不同，所受影響不明顯，平均生存時間為（10.0±4.1）個月，與文獻(xiàn)[9-11]中8～11個月接近。

綜上所述，本研究中EGFR基因突變率在原發(fā)灶中與性別、組織學(xué)類型、吸煙密切相關(guān)，而在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性，影響預(yù)后，今后隨著對腫瘤異質(zhì)性的深入研究，將會對臨床采用個性化靶向治療提供進(jìn)一步理論依據(jù)。

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Analysis of mutations situation and clinical significance of epidermal growth factor receptor gene in primary focus and metastatic focus of non-small cell lung cancer

QING SongLIU MingSHI YiWANG BoweiMA Yuqing▲
Department of Pathology,the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uighur Autonomous Region,Urumqi830054,China

Objective To investigate the mutations situation of epidermal growth factor receptor(EGFR)gene in primary focus and metastatic focus of non-small cell lung cancer(NSCLC),and to analyze the relationship of the mutation rate of it in different focus and clinicopathologic feature.Methods The TaqMan probe method of real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect the conditions of EGFR gene mutation in primary focus and metastatic focus of 50 cases with NSCLC,and its correlation with clinicopathologic feature was analyzed through statistical software.Results Among the primary focus of 50 cases with NSCLC,the gene mutation rate of EGFR was 38.0%(19/50),which was closely correlated with gender,histopathological type,smoking(P＜0.05),which had no correlations with age,differentiated degree,postion,nation,clinical stages(P＞0.05);the mutation rate in metastatic focus was 22.0% (11/50),which had a statistically significant difference compared with gene mutation rate of EGFR in primary focus(P＜0.05),while it had no correlations with other clinicopathologic features(P＞0.05).Conclusion The gene mutation of EGFR was mainly concentrated on female,pulmonary adenocarcinoma,non-smoking patients,and shows different mutation in primary focus and metastatic focus of NSCLC,put up the heterogeneity of tumor,which affects the curative effect.

Epidermal growth factor receptor;Non-small cell lung cancer;Primary focus;Metastatic focus;Real-time polymerase chain reaction

R734.2

A

1673-7210（2015）07（c）-0021-05

2015-03-19本文編輯：張瑜杰）

▲通訊作者