索拉非尼誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

李 璇，吳 超，肖佩玲，鄧 坦

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，長沙 410005）

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞腫瘤，好發(fā)于中老年，但近年發(fā)病率有增高及發(fā)病年齡有提前趨勢。目前臨床常用藥物對 MM 的治療效果并不理想，其特效化療藥物沙利度胺抗腫瘤機(jī)制之一為通過作用于 VEGF 受體達(dá)到抑制腫瘤血管生成，但完全緩解率較低且易復(fù)發(fā)。而且，沙利度胺的多項副反應(yīng)制約了它的進(jìn)一步應(yīng)用，如強(qiáng)烈的致畸作用、周圍神經(jīng)病變、血栓等。所以亟需挖掘新的安全有效的藥物治療 MM 是目前的關(guān)鍵。索拉非尼（Sorafenib）是一種多靶點分子靶向藥物，目前廣泛應(yīng)用于晚期肝癌及腎癌治療，它的作用靶點包括 RAF 激酶、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR－β、c-Kit 和 FLT-3等，它可通過抑制 VEGF 受體和 PDGFR 而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長［1］。但索拉非尼對 MM 的作用及其機(jī)制目前尚不清楚，本研究嘗試探索不同濃度索拉非尼對 MM 細(xì)胞 U266 的增殖、凋亡等作用的影響，并進(jìn)一步檢測其影響相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子如 VEGFR、PDGFR 的表達(dá)水平，以達(dá)到從細(xì)胞層面了解索拉非尼治療 MM 的可行性，為后續(xù)更多相關(guān)機(jī)制及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器及細(xì)胞株索拉非尼（Sorafenib）是德國拜耳公司惠贈。RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國 Gibco 公司。二甲基亞砜（DMSO）由湖南省人民醫(yī)院臨床研究所提供。噻唑藍(lán)（MTT）、細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）購于碧云天生物技術(shù)研究所。AnnexinV-FITC/PI購于北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas 公司。SYBDREEN PCR MIX 購于 ABI 公司。DL2000 DNA Marker、Taq 酶、Trizol、DEPC、6*loading buffer、dNTP 購于 Genstar 公司。Q-PCR 引物在上海生工生物公司訂制。羊抗鼠 VEGFR-3、PDGFR-β 單克隆抗體購于美國 Proteintech 公司。流式細(xì)胞儀 ACEA NovoCyte TM 購于北京艾格斯生物有限公司。熒光定量 PCR 儀 PIKO REAL 96、SuperECL PLUS 超敏發(fā)光液購于美國 Thermo 公司。人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 細(xì)胞株購于上海美軒生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 于10 %滅活胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37 ℃、5 %CO2 濕化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每1 天換液一次，隔2-3 天傳代一次。實驗選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.3 MTT 檢測細(xì)胞增值抑制率分別取100 μL 細(xì)胞（5×103 /mL）接種于九十六孔板中。將索拉非尼的藥物終濃度配成0、1.5、3.0、6.0、12、15、20 μmol/L，用不加細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白和陰性對照組，每組設(shè)10 個平行孔（每組邊緣兩孔用細(xì)胞培養(yǎng)基配平，減少細(xì)胞誤差）。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h 后離心，除去上清后各加入100 μL DMSO，振蕩器上振蕩5 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，然后于酶標(biāo)儀570 nm 波長處檢測各孔的吸光度（OD）值。

其中，細(xì)胞板計數(shù)及細(xì)胞抑制率公式如下：

細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104 個/mL（壓線細(xì)胞只記左側(cè)和上方）

細(xì)胞抑制率=［1-（實驗組OD 值-空白對照組OD值）/陰性對照組OD 值-空白對照組OD 值］×100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率按照 Annexin-V FITC/PI 雙染試劑盒的說明操作，依照 MTT 中索拉非尼的藥物濃度（除去高濃度20 umol/L 組）孵育細(xì)胞48 h后用 PBS 重懸細(xì)胞，取5×105 細(xì)胞懸液離心后去除上清，再加入500 μL 的1×結(jié)合緩沖液混勻。接著依次加入5 μL Annexin-V FITC 及10 μLPI，充分搖勻。于室溫下避光反應(yīng)10 min。最后，在30 min 之內(nèi)置于流式細(xì)胞儀中檢測。

1.5 Q-PCR 檢測目的基因表達(dá)Human-VEGFR2（Forward：5'-GAGTGGCAGTGAGCAAAGGG-3'，Reverse：5'-CATAGACATAAATGACCGAGGC-3'）；Human-VEGFR3（Forward：5'-TGCCTGCGACTGTGGCTCTG-3'，Reverse：5'-CCCGTGTCCTCGCTGTCCTTGT-3'）；Human-PDGFR（Forward：5'-CCGAACATCATCTGGTCTGCC-3'，Reverse：5'-CAAACTCCTGCTCCTCCTCCC-3'）；Human-C-KIT（Forward：5'-GCTCTGCTTCTGTACTGCCA-3'，Reverse：5'-GGTGTGGGGATGGATTTGCT-3）；Forward：5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，Reverse：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'（β-actin）。采用Trizol 提取細(xì)胞總 RNA，運用分光光度計測取在260 和280 nm 處的吸光度值A(chǔ)，選取A260 計算出 RNA 的濃度用于反轉(zhuǎn)錄（RNA 濃度=A260×稀釋倍數(shù)×40 ng/ml）。逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)總體積為30 μL，包括 cDNA 1 ul，上下游引物各0.5 μL，PCR H2O 13 μL，2× SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。

擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，59 ℃退火，72 ℃延伸，共40 個循環(huán)，每個循環(huán)1 min。取5 ul PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2 %的瓊脂糖凝膠，在170 V 下恒壓電泳，待溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠總長2/3 處停止電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察。將目的基因結(jié)果于 β-actin 的灰度比值進(jìn)行半定量分析。

1.6 Western-blot 檢測目的蛋白表達(dá)讓不同濃度索拉非尼孵育多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 48 h 后 PBS 重懸細(xì)胞去上清，然后按蛋白抽提試劑盒說明提取總蛋白。用 BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，第一孔加入 maker，其它每孔用 5×loading buffer 配平總量為20 μg 上樣于120 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍(lán)至凝膠底部時，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用 1×TBST 配制5 % 脫脂奶粉液室溫封閉2 h 后，加入一抗4 ℃ 搖床孵育過夜，用 TBST 洗膜3 次后，加二抗室溫孵育1 h 。再用 TBST 洗膜3 次，ECL 顯色曝光，目的蛋白條帶的表達(dá)情況由 IPP 光密度分析軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理用 SPSS18.0 軟件包進(jìn)行t 檢驗以及直線回歸，以雙側(cè)α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 增殖影響

MTT 檢測結(jié)果顯示：索拉非尼對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266 具有較明顯的抑制作用。跟對照組相比，除了小于3 μmol/L（P>0.05）以外，各實驗組抑制率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P﹤0.05）。并且，抑制率隨藥物濃度遞增而增高，表明了索拉非尼對骨髓瘤細(xì)胞 U266 的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性（r=0.537）。此外，同一濃度在24、48、72 h 不同時間段的細(xì)胞抑制率也存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P﹤0.05），隨孵育時間延長抑制率隨之增高，表明索拉非尼對骨髓瘤細(xì)胞 U266 的抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性（r=0.392）（圖1）。

圖1 .索拉非尼對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 增殖影響

2.2 索拉非尼對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266 凋亡影響由圖2 可見，右上象限表示晚期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，右下象限表示早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。檢測結(jié)果表明索拉菲尼孵育 U266 細(xì)胞株48 h 后，除了小于3 μmol/L（P>0.05）以外，其它各實驗組凋亡率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P﹤0.05）（圖2）。

圖2 .索拉非尼處理U266 48h細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.3 索拉非尼對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β及 c-Kit 的影響不同濃度索拉非尼處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 48 h 后檢測各組 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 及 c-Kit 的 mRNA表達(dá)及 VEGFR-3、PDGFR-β 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：各實驗組與對照組比較，VEGFR-2、VEGFR-3 及PDGFR-β 的 mRNA 的表達(dá)均隨索拉非尼濃度的增加而減弱，尤其是 VEGFR-3 和 PDGFR-β（圖3）。其中，c-Kit 的表達(dá)不呈濃度依賴性，但表達(dá)也相對減弱。同時，Western-blot 檢測 VEGFR-3 與 PDGFR-β 的蛋白表達(dá)結(jié)果與 Q-PCR 結(jié)論一致（圖4）。

圖3 .索拉非尼處理48 h對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 及 c-Kit 的影響

圖4 .索拉非尼處理48 h U266 VEGFR3，VEGFR2，PDGFR-β，c-Kit 表達(dá)

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)中常見惡性腫瘤之一，目前治療方案尚不理想。雖然，化療聯(lián)合自體造血細(xì)胞移植以及有效藥物如硼替佐米、來那度胺等臨床應(yīng)用，使患者近期緩解率以及生存率有所緩解，但是遠(yuǎn)期臨床耐藥和復(fù)發(fā)仍然是臨床治療失敗的主要原因。因此亟需挖掘一種有效安全的藥物來治療多發(fā)性骨髓瘤。

索拉菲尼（Sorafenib，多吉美）是二芳基脲類的新型藥物之一，由 Onyx 和 Bayer 公司共同研制。其中，被美國食品和藥物管理局（FDA）于2005 年12 月批準(zhǔn)用于晚期腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌［2］的治療。而且，索拉菲尼是第一個口服的多激酶抑制劑，主要的作用靶點是 MAPK途徑［3］，同時也是被證實的唯一可延長進(jìn)展和總生存時間（OS）的靶向藥物［4］。多發(fā)性骨髓瘤予以索拉菲尼治療一直是研究重點［5］，在 MM 細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用中，骨髓微環(huán)境提供了一些必要的生存信號，如細(xì)胞因子，VEGF［6］，IL-6［7］以及 IGF-1［8］。而上述的細(xì)胞因子均可激活 Ras/ Raf 的 MEK / ERK 途徑，這也已經(jīng)被證實用于骨髓瘤細(xì)胞的存活［9］。因此，本研究認(rèn)為深入挖掘索拉菲尼對多發(fā)性骨髓瘤的作用機(jī)制，可為臨床提高 MM 的治療及預(yù)后的評估提供分子層面的依據(jù)。

本研究采用了 MTT 法檢測了索拉菲尼對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 細(xì)胞株的增值抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索拉菲尼可抑制 U266 細(xì)胞株的增值，且呈現(xiàn)一定范圍內(nèi)的濃度-時間依賴性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明索拉菲尼組凋亡率明顯高于對照組，更進(jìn)一步證實索拉菲尼可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡［10］。運用 Q-PCR 和 Western-blot 檢測法在基因和蛋白水平都證實了索拉菲尼對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266的抑制作用。但是，索拉菲尼具體的促人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 凋亡機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，索拉菲尼對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 U266 有抑制增值和誘導(dǎo)凋亡作用。凋亡的主要機(jī)制可能是通過激活凋亡信號通路，抑制 VEGFR-3 和PDGFR-β 的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

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