枯草芽孢桿菌BJ3-2 S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因speD的克隆與序列分析

王亞娟，韓忠安，羅信旭，吳擁軍*

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

生物胺（biogenic amines，BA）是一類主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的弱堿性低分子質(zhì)量含氮化合物[1]，是人體內(nèi)的正常生理活性物質(zhì)，但當(dāng)體內(nèi)攝入過量生物胺時(shí)會(huì)引起頭痛、心悸等一系列不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，生物胺還具有潛在的致癌性，生物胺存在于食品中也會(huì)影響食品風(fēng)味甚至改變其成分風(fēng)味[2-3]。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC 或AdoMet-DC）是多胺合成代謝中的3個(gè)關(guān)鍵酶之一[4-5]。其存在于細(xì)菌、真菌、古生菌和植物體內(nèi)，在多胺生物合成過程中起著重要的作用，它以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）為底物催化形成脫羧S-腺苷甲硫氨酸，為精胺和亞精胺的合成提供氨丙基，是精胺和亞精胺合成的限速酶[6-7]。近年已有人類及多種植物的SAMDC 基因被分離鑒定，并證明其在多胺合成中具有重要作用[8]。食品中主要存在的生物胺包括組胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、β-苯乙胺、精胺和亞精胺。

豆豉是我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，經(jīng)微生物發(fā)酵以色香誘人、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者的喜愛。目前已報(bào)道的貴州地區(qū)水豆豉主酵微生物是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是細(xì)菌型豆豉生產(chǎn)的安全菌株[9]。據(jù)報(bào)道，與枯草芽孢桿菌同屬的納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中檢測到了亞精胺、精胺、腐胺、酪胺4種生物胺[10-11]，但豆豉發(fā)酵過程中是否會(huì)產(chǎn)生過量的生物胺還不得而知。枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中分泌的脫羧酶能夠?qū)被峤?jīng)過脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的胺類物質(zhì)[10]。在前期的研究中，實(shí)驗(yàn)室已從貴州地區(qū)豆豉樣品中分離獲得了可作為生產(chǎn)應(yīng)用的菌株BJ3-2[12]，以Bacillus subtilisBJ3-2基因組為模板，克隆S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（SAMDC）基因（speD），并與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌的speD序列進(jìn)行同源性比對分析，推測SAMDC活性結(jié)構(gòu)域和酶活性位點(diǎn)，研究為SAMDC活性影響因素的進(jìn)一步研究和豆豉生產(chǎn)中的安全評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）BJ3-2：實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)氯化鈣法制備；質(zhì)粒pGEM-T載體：美國Promega公司。

T4 DNA連接酶、Taq（聚合）酶、DNA Marker、dNTP、10×PCR Buffer等：大連TaKaRa公司；基因組提取試劑盒：北京Promega生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒：美國OMEGA生物技術(shù)公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler PCR儀、PowerPac HC電泳儀、Gel Doc XR型UniversalHood凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；SKY-2102C型恒溫?fù)u床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-IFD型標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

查詢GenBank獲得B.subtilis168菌株的speD序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)speD特異性克隆引物。結(jié)果見表1。

表1 擴(kuò)增目的基因的名稱及引物序列Table 1 Name of target gene amplified and its primer sequence

1.3.2B.subtilisBJ3-2基因組提取、質(zhì)粒提取

依照試劑盒說明書進(jìn)行；片段回收、連接、轉(zhuǎn)化參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

以B.subtilisBJ3-2的gDNA為模板，引物speDF/speDR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：模板1 μL、dNTP 1.6 μL、10×PCR Buffer 2 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq酶0.1 μL、ddH2O 14.3 μL，總體系為20 μL。

1.3.4 重組子鑒定

經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，重組質(zhì)粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1921年中國共產(chǎn)黨成立后就立即研究在各地建立和發(fā)展社會(huì)主義青年團(tuán)，并派出許多黨員去加強(qiáng)對各地團(tuán)的早期組織的領(lǐng)導(dǎo)工作。1922年5月，中國社會(huì)主義青年團(tuán)第一次全國代表大會(huì)開幕。大會(huì)通過的團(tuán)的綱領(lǐng)確定了中國社會(huì)主義青年團(tuán)為中國青年無產(chǎn)階級(jí)的組織，是為解放無產(chǎn)階級(jí)而奮斗的組織。此后十幾年間，共青團(tuán)組織在黨的領(lǐng)導(dǎo)下，帶領(lǐng)各地的團(tuán)員青年相繼投身工人運(yùn)動(dòng)、改組國民黨、北伐戰(zhàn)爭、反對國民黨統(tǒng)治的斗爭中去?？谷諔?zhàn)爭爆發(fā)后，為了建立抗日民族統(tǒng)一戰(zhàn)線，更廣泛地團(tuán)結(jié)各界青年投入抗日救亡的斗爭，共產(chǎn)主義青年團(tuán)響應(yīng)黨的號(hào)召，主動(dòng)改造變身為各種抗日救國的青年團(tuán)體，為抗戰(zhàn)的勝利做出了突出貢獻(xiàn)。

1.3.5speD序列分析

用DNAStar和MEGA5生物學(xué)軟件對speD的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行編輯，與GenBank中已發(fā)表的其他speD序列進(jìn)行同源性分析并繪制SAMDC遺傳進(jìn)化樹[14]。使用Clustalw2和GeneDoc生物學(xué)軟件進(jìn)行多序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilis BJ3-2g DNA的提取

提取B.subtilisBJ3-2基因組，樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。圖1顯示所提取的B.subtilisBJ3-2 gDNA較完整，無顯著降解，可用于目的基因的PCR擴(kuò)增。

圖1 枯草芽孢桿菌BJ3-2基因組Fig.1 Genome of Bacillus subtilis BJ3-2

2.2 speD的PCR擴(kuò)增

將克隆產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，目的條帶約與預(yù)期片段（381 bp）相符。

圖2 PCR擴(kuò)增speD基因Fig.2 PCR amplification of speD

2.3 重組克隆質(zhì)粒的菌落PCR鑒定

挑取單菌落，經(jīng)菌落PCR檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知，2、4、6、7泳道在預(yù)期大小處有克隆條帶，初步認(rèn)定為陽性重組菌。

圖3 菌落PCR鑒定重組子Fig.3 PCR recombinant identification of colony

2.4 重組質(zhì)粒PCR鑒定

將鑒定的陽性重組菌落4進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在預(yù)期大小處出現(xiàn)克隆條帶，說明目的基因已正確克隆至pGEM-T 載體中。將提取的重組質(zhì)粒送生物公司測序，并命名為pGEM-speD。

圖4 質(zhì)粒PCR鑒定Fig.4 PCR identification of plasmid

2.5 speD的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在GenBank數(shù)據(jù)庫中將所克隆基因序列和推導(dǎo)的蛋白序列進(jìn)行序列同源性比對，分析結(jié)果表明，B.subtilisBJ3-2的speD序列與已報(bào)道枯草芽孢桿菌的speD基因序列和蛋白序列高度同源，與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）的核苷酸序列相似性達(dá)96%，與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）達(dá)93%以上，與其他芽孢桿菌在85%以上。其氨基酸序列與芽孢桿菌NSP9.1（Bacillussp.NSP9.1）同源性達(dá)到97%、與印度芽孢桿菌（Bacillus indicus）LMG 22858同源性達(dá)到95%、與索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）達(dá)到96%，與芽孢桿菌屬其他多種菌種的SAMDC氨基酸序列在90%以上。表明所克隆的基因是編碼SAMDC的基因。

所有生物的腺苷甲硫氨酸脫羧酶都是依賴丙酮?；拿?，依據(jù)其剪切位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征和酶活性離子，將之分為兩大類：Ⅰ類酶主要存在于細(xì)菌和古細(xì)菌；Ⅱ類酶主要存在于真核生物中。SAMDC活性酶是從來源于絲氨酸自我剪切而產(chǎn)生的具有催化活性的丙酮?；揎棶a(chǎn)生的，盡管兩類酶的形成都是利用丙酮?；?，經(jīng)歷同樣的自身成熟過程，但是除了丙酮酰基位點(diǎn)外Ⅰ類和Ⅱ類酶幾乎沒有序列相似性[15]。

Ⅰ類酶可分為兩類，Ⅰ類A型：SAMDC主要包括革蘭氏陰性細(xì)菌，活性酶的形成需要二價(jià)金屬離子（如Mg2+）的參與催化形成（αβ）4四聚物；Ⅰ類B型：SAMDC包括革蘭氏陽性細(xì)菌和古細(xì)菌，如桿狀菌和詹氏甲烷球菌，形成（αβ）2二聚物，并且不需要鎂離子或其他的活性劑參與[16-17]。

Ⅱ類酶主要包括來自于動(dòng)物、植物、真菌和錐體蟲（無脊椎）的腺苷甲硫氨酸脫羧酶。Ⅱ類A包括來自于動(dòng)物的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC），是（αβ）2二聚物和需要腐胺作為激活因子。Ⅱ類B包括來自于植物的AdoMetDC，是（αβ）單體和不需要腐胺作為激活因子。Ⅱ類C包括來自于錐體蟲（無脊椎）的AdoMetDC異二聚體，具有αβπ′亞基結(jié)構(gòu)。鐮狀瘧原蟲的AdoMetDC 是一種雙功能蛋白，C末端具有鳥氨酸脫羧酶活性。

研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的SAMDC與古生菌的SAMDC密切相關(guān)。B.subtilisBJ3-2與B.subtilis168屬于枯草芽孢桿菌，詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）和嗜熱泉生古細(xì)菌（Aeropyrum pernixK1）屬于古生菌，海棲熱孢菌（Thermotoga maritima）都屬于Ⅰ類B型AdoMetDC，且海棲熱孢菌（T.maritima）的AdoMetDC的晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建為Ⅰ類B型AdoMetDC（PDB code 1TLU）的酶活性以及結(jié)構(gòu)的分析提供了理論基礎(chǔ)[17]。選擇這些細(xì)菌的SAMDC的氨基酸序列作比對，推測B.subtilisBJ3-2的SAMDC酶原剪切位點(diǎn)及酶活性位點(diǎn)。根據(jù)大腸桿菌（Escherichia coli）和人類（Homo sapiens）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SAMDC氨基酸序列以及同源性較高的芽孢桿菌SAMDC序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步分析它們之間的進(jìn)化關(guān)系。

ClustalW多序列比對，GeneDoc輸出，圖5結(jié)果顯示B.subtilisBJ3-2的SAMDC基因?qū)儆诒嵋蕾囆兔擊让傅蘑耦怋型S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶家族，具有酶原剪切結(jié)構(gòu)域：（53 GVSGVVIISESHLTIH 68）結(jié)構(gòu)域，其中ESH三個(gè)氨基酸殘基高度保守，包括有丙酮酰前體絲氨酸和酶原剪切位點(diǎn)；第二個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：（82 TCG 84）結(jié)構(gòu)域，在這個(gè)結(jié)構(gòu)域中CG兩個(gè)氨基酸殘基高度保守，具有親核催化作用的半胱氨酸殘基，對酶的催化活性具有重要作用。

圖5 B.subtilis BJ3-2和其他細(xì)菌SAMDC的氨基酸多序列比對Fig.5 Multiple alignments between amino acid sequence of B.subtilis BJ3-2 and other bacteria

圖6 不同類型S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed with amino acid sequences of different types of S-adenosylmethionine decarboxylase

從圖6可以看出，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的SAMDC位于遺傳距離較近的同一進(jìn)化分支，彼此親緣關(guān)系較近，B.subtilisBJ3-2與B.subtilis168和B.subtilisBSP1的SAMDC遺傳距離最近，詹氏甲烷球菌（M.jannaschii）、嗜熱泉生古細(xì)菌（A.pernix）K1 和海棲熱孢菌（T.maritima）的SAMDC遺傳距離次之，與E.coli[A7ZHK9]的SAMDC位于遺傳距離稍遠(yuǎn)的同一進(jìn)化分支，與人類（H.Sapiens）[NP_001625]、擬南芥（A.thaliana）[AEE73813]的SAMDC遺傳距離最遠(yuǎn)。以上分析顯示B.subtilisBJ3-2 的SAMDC具有丙酮酸依賴型脫羧酶酶原剪切結(jié)構(gòu)域，屬于典型的Ⅰ類B型SAMDC家族成員。

3 結(jié)論

SAMDC是多胺合成代謝過程中的限速酶，是精胺和亞精胺合成的關(guān)鍵酶，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)GenBank中枯草芽孢桿菌168菌株（登錄號(hào)為AL009126.3）的speD編碼基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，通過PCR技術(shù)從B.subtilisBJ3-2菌株中擴(kuò)增得到SAMDC基因序列，與預(yù)期大小相吻合。通過序列比對、保守結(jié)構(gòu)域分析，B.subtilisBJ3-2 的SAMDC具有丙酮酸依賴型脫羧酶酶原剪切結(jié)構(gòu)域[53 GVSGVVIISESHLTIH 68]和保守結(jié)構(gòu)域[82 TCG 84]，屬于典型的的Ⅰ類B型S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶家族成員，其關(guān)鍵的活性位點(diǎn)氨基酸殘基，即絲氨酸（Ser，S）Ser55、絲氨酸Ser63、組氨酸（His，H）His68、半胱氨酸（Cys，C）Cys83，與底物結(jié)合、酶的催化及酶原的加工過程相關(guān)。

在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中其多胺的合成是始于精氨酸，由精氨酸脫羧酶、胍基丁胺酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶以及亞精胺合酶、精胺合酶共同參與作用的。所以應(yīng)同時(shí)對這幾個(gè)基因進(jìn)行研究，以進(jìn)一步了解枯草芽孢桿菌生物多胺的合成途徑。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以選擇合適的表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，對其酶活力和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。綜合細(xì)菌型豆豉生物發(fā)酵特點(diǎn)，使得氨基酸脫羧酶既能滿足豆豉發(fā)酵條件的需要又能有效控制豆豉產(chǎn)品中生物胺的含量，為有效保證豆豉產(chǎn)品的生物安全性提供理論指導(dǎo)。

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