苯甲醛左氧氟沙星席夫堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡作用

霍　菲，唐乃夫，范媛媛，劉詩(shī)濛，張　瑩，梁紅霞，胡國(guó)強(qiáng)，劉　彬

(河南大學(xué)1.護(hù)理學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所、2.淮河臨床學(xué)院、3.藥學(xué)院，河南開封　475004)

?

苯甲醛左氧氟沙星席夫堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡作用

霍菲1，唐乃夫1，范媛媛1，劉詩(shī)濛2，張瑩2，梁紅霞1，胡國(guó)強(qiáng)3，劉彬1

(河南大學(xué)1.護(hù)理學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所、2.淮河臨床學(xué)院、3.藥學(xué)院，河南開封475004)

摘要:目的研究苯甲醛左氧氟沙星席夫堿化合物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法用不同濃度的(S) -1，8-(2-甲基亞乙氧基) -6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基) -3-［S-芐基硫基-4-(對(duì)硝基苯甲叉基氨基) -1，2，4-均三唑-3-基］-喹啉(1-H) -4-酮(M18)與SMMC-7721細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞MB-231、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人肝癌細(xì)胞HEPG-2和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)M18對(duì)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用; Hoechst 33258熒光染色法、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化;高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位(△ψm)變化; Western blot方法測(cè)定caspase-3、p53蛋白表達(dá)量的改變，以及細(xì)胞色素C在線粒體內(nèi)外的分布。結(jié)果M18在4～32 μmol·L(－1)的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞、MB-231細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、HEPG-2細(xì)胞增殖，呈濃度、時(shí)間依賴關(guān)系，作用于細(xì)胞24 h的IC(50)值分別為8.65、9.37、12.74和9.40 μmol·L(－1);左氧氟沙星鹽酸鹽作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h的IC(50)值為735.10 μmol· L(－1)，M18作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h的IC(50)值為38.96 μmol·L(－1);不同濃度M18作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P＜0.05)。M18作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞線粒體膜電位降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; M18明顯增加SMMC-7721細(xì)胞的p53和caspase-3蛋白表達(dá)量，其中caspase-3活性裂解片段增加明顯; M18作用使細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C明顯增加。結(jié)論苯甲醛左氧氟沙星席夫堿能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，作用與線粒體凋亡通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞:氟喹諾酮席夫堿;肝癌細(xì)胞;細(xì)胞增殖;凋亡;線粒體膜電位; p53

氟喹諾酮羧酸是一類廣泛應(yīng)用于臨床的化學(xué)合成抗菌藥物，作用靶點(diǎn)是細(xì)菌的DNA回旋酶(gyrase)，抑制細(xì)菌增殖［1］。真核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα和Ⅱβ的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列與細(xì)菌的回旋酶非常相似，其中拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡN端結(jié)構(gòu)域(1-670氨基酸)與DNA回旋酶的B亞基(GyrB)具有同源性。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的中部結(jié)構(gòu)域(671-1200氨基酸)與DNA回旋酶的A亞基(GyrA)具有同源性，結(jié)構(gòu)中包含的酪氨酸活性位點(diǎn)對(duì)催化DNA斷裂和再連接十分必要［2］。目前，已有多種臨床應(yīng)用抗腫瘤藥物的作用靶酶是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ［3］。部分抗菌氟喹諾酮羧酸對(duì)真核細(xì)胞增殖有較弱的抑制作用，例如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等［4］。課題組的前期研究結(jié)果顯示，將氟喹諾酮羧酸的C-3羧基與酰腙類化合物結(jié)合所合成的新型氟喹諾酮衍生物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ具有較強(qiáng)的抑制作用［5－6］，促進(jìn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的PBR332質(zhì)粒DNA解旋和斷裂，抑制DNA再連接反應(yīng)，作用與臨床應(yīng)用的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑依托泊苷一致［7－8］。本研究以左氧氟沙星為先導(dǎo)化合物，用12種結(jié)構(gòu)單元替代左氧氟沙星分子結(jié)構(gòu)的C-3羧基，合成一系列左氧氟沙星C-3酰腙衍生物。其中苯甲醛左氧氟沙星席夫堿(S) -1，8-(2-甲基亞乙氧基) -6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基) -3-［S-芐基硫基-4-(對(duì)硝基苯甲叉基氨基) -1，2，4-均三唑-3-基］-喹啉(1-H) -4-酮(M18，F(xiàn)ig 1)活性最強(qiáng)，IC50值達(dá)8.65 μmol·L－1，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

Fig 1　Structure of(S) -1，8-(2-methyl phosphate ethoxy) -6-fluorine-7-(4-methyl-piperazine-1-base) -3-［S-benzyl s－based-4-(for nitrobenzene methylene group amino) -1，2，4-all triazole-3-base］-quinoline (1-H) -4-ketone

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1誘導(dǎo)劑苯甲醛左氧氟沙星席夫堿由河南大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究所設(shè)計(jì)、改造并合成，HPLC法測(cè)定純度＞99%，溶解在二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司)中，濃度為1×10－2mol·L－1。

1.1.2細(xì)胞株和主要試劑人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HEPG-2、人乳腺癌細(xì)胞MB-231、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，生長(zhǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，置體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DeadEndTMFluorometric TUNEL System(Promega公司) ;線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司) ; caspase-3、p53、細(xì)胞色素C抗體(Cell Signaling Technology) ;β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(中杉金橋公司) ; Hoechst 33258 (Sigma公司)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma，3121，USA) ;酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Ascent，USA) ; BX51熒光顯微鏡(Olympus公司) ; DYY-7C型轉(zhuǎn)移電泳儀、垂直電泳儀、半干式電轉(zhuǎn)裝置、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠) ;高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific，USA)。

1.2方法

1.2.1MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞以16×107·L－1濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入不同濃度的M18，分別培養(yǎng)24、48、72 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 0.15 ml振蕩10 min，至藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm吸收度(A)值并計(jì)算抑制率。以含等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無細(xì)胞孔測(cè)的吸光度值為空白對(duì)照。根據(jù)中效方程式［fa/fu=(D/Dm) m］計(jì)算出中效濃度(IC50)［9］。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=［1－(處理組吸收度－空白對(duì)照組吸收度)/(對(duì)照組吸收度－空白對(duì)照組吸收度)］×100%。

1.2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)法取C57BL/6J小鼠兩只，6～8周齡。在無菌條件下迅速取出雙下肢骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，再用4號(hào)針頭吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照600×107·L－1到800×107·L－1的密度接種至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，每3天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞密度達(dá)80%后傳代培養(yǎng)。

1.2.3Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

細(xì)胞以1×108·L－1濃度接種于放置蓋玻片的6孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的M18培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，多聚甲醛固定15 min，30 μL Hoechst 33258工作液于蓋玻片上，室溫染色10 min。PBS漂洗2次，中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.4TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率取1×108·L－1細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞于放置蓋玻片的6孔板，用不同濃度的M18作用24 h，按Promega公司的試劑盒說明書操作，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5線粒體膜電位(△ψm)測(cè)定以8×107· L－1的濃度接種細(xì)胞到6孔板，用不同濃度的M18培養(yǎng)24 h，每孔加入1 mL的Rh-123稀釋液1 h，PBS 洗3遍，加入終濃度為5 mg·L－1的Hoechst 33342避光染色10 min，PBS洗滌，高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2.6線粒體蛋白的分離常規(guī)收集經(jīng)不同濃度M18作用24 h的細(xì)胞，12 000 r·min－1離心10 min，PBS洗滌，按照細(xì)胞線粒體分離試劑盒說明書提取細(xì)胞線粒體蛋白與胞質(zhì)蛋白。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)不同濃度M18作用細(xì)胞24 h，RIPA裂解液200 μL充分裂解細(xì)胞，4℃離心(12 000 r·min－1) 5 min提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250法分光光度計(jì)測(cè)樣品蛋白濃度，12% SDSPAGE電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶2 000) 4℃封閉過夜，二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體1∶4 000)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有資料均采用SPSS 14.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析。

Fig 2 Proliferation inhibition effect of M18 and levofloxacin on human cancer cells and BMSCs

2　結(jié)果

2.1M18對(duì)各種腫瘤細(xì)胞和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度的M18分別作用于SMMC-7721、MB-231、HCT-116和HEPG-2細(xì)胞24、48 和72 h，M18對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)增殖抑制作用，并呈時(shí)間與濃度依賴關(guān)系，24 h的IC50值分別是8.65 μmol·L－1(r2=0.8841)、9.37 μmol·L－1(r2=0.8523)、12.74 μmol·L－1(r2=0.7994)和9.40 μmol ·L－1(r2=0.8218) ; M18分別作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24、48和72 h，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，24 h的IC50值為38.96 μmol·L－1(r2=0.7822) ; M18合成原料左氧氟沙星對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響不明顯，24 h的IC50值為735.10 μmol·L－1(r2=0.6854) (Fig 2)。

2.2M18誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，M18作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、核呈碎片狀等凋亡形態(tài)學(xué)變化(Fig 3)。TUNEL結(jié)果顯示，隨著M18濃度增加，凋亡細(xì)胞明顯增多，呈濃度依賴性(Fig 4，Tab 1)。

Fig 3 SMMC-7721 cell apoptosis under fluorescent microscope stained by Hoechst 33258 (×200)

2.3M18對(duì)線粒體膜電位的影響Rh-123熒光強(qiáng)度可以間接反映線粒體膜的破壞程度。M18作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，隨著化合物濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大，表明細(xì)胞線粒體膜電位降低，與對(duì)照組比較，分別降低(8.97±4.15) %、(31.82±5.29) %、(47.25±6.03) %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見Fig 5。

2.4M18對(duì)p53、caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞色素C線粒體內(nèi)外分布的影響以2.467、8.650、26.401 μmol·L－1M18分別作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，Western blot法檢測(cè)p53、caspase-3的表達(dá)和細(xì)胞色素C線粒體內(nèi)外分布。與對(duì)照組相比，M18作用后細(xì)胞p53蛋白表達(dá)明顯增加，呈明顯的濃度依賴關(guān)系，caspase-3蛋白表達(dá)量增多，活性片段增多。細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C分布降低，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C分布增多，提示M18誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用可能與線粒體凋亡通路有關(guān)，見Fig 6。

Fig 4 Induction of apoptosis of SMMC-7721 cells treated with M18 for 24 h evaluated by TUNEL assay

Tab 1 Apoptotic effects of M1?8 on SMMC-7721 cells (±s，n=9)

Tab 1 Apoptotic effects of M1?8 on SMMC-7721 cells (±s，n=9)

*P＜0.05 vs control

Group　Dose/μmol·L－1Apoptotic ratio/% Control　0.0113±0.00418 M18　2.476　0.1950±0.01586*8.650　0.3822±0.03639*26.401　0.5306±0.06966*

3　討論

Fig 5 Changes in MMP of SMMC-7721 cells induced by M18 for 24 h and analyzed by HCS after staining with Rh-123

部分臨床常用的氟喹諾酮類抗菌藥物對(duì)真核細(xì)胞的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有較弱的抑制作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮羧酸C-3位羧基對(duì)抗菌活性必需，對(duì)抗腫瘤活性并非必要，為尋找新型抗腫瘤氟喹諾酮候選物提供思路［11－12］。本課題組以左氧氟沙星為底物，用結(jié)構(gòu)單位替代C-3位羧基，合成12種左氧氟沙星衍生物，用MTT法檢測(cè)12種喹諾酮類衍生物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用，多數(shù)化合物顯示出對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的不同程度生長(zhǎng)抑制作用，IC50值在50 μmol·L－1以下，其中M18對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用效果最好，24h的IC50值達(dá)8.65 μmol· L－1，其合成原料左氧氟沙星對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響不明顯，IC50值達(dá)735.10 μmol·L－1，說明化合物改造符合理論推測(cè)，具有較好的研究開發(fā)價(jià)值。為了解M18對(duì)各種腫瘤組織作用的差異，本研究選用4種不同類型的腫瘤細(xì)胞株(結(jié)腸癌HTC-116細(xì)胞、乳腺癌MB-231細(xì)胞、人肝癌HEPG-2細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞)，檢測(cè)M18對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果證明，M18對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯增殖抑制作用，并呈時(shí)間與濃度依賴性。本研究同時(shí)應(yīng)用原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)M18的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，IC50值為38.96 μmol· L－1，明顯高于M18對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用的IC50值。說明M18對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的選擇性，在未來臨床應(yīng)用中可能具有較小的毒副作用。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，經(jīng)C-3羧基改造的氟喹諾酮衍生物的作用靶點(diǎn)是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，造成腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，這種作用可能激活p53蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13－14］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot法檢測(cè)p53表達(dá)量的改變，提示M18殺傷SMMC-7721細(xì)胞的作用可能通過DNA損傷，p53增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑。應(yīng)用Hoechst 33258熒光染色法觀察SMMC-7721細(xì)胞核形態(tài)變化，觀察到M18作用24h凋亡SMMC-7721細(xì)胞增加，表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、核邊移、核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體等凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。TUNEL法顯示，隨著M18濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高。Western blot結(jié)果也證明，隨著M18濃度的增加，caspase-3表達(dá)量增多，裂解片段增加。說明通過激活caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。從理論上推測(cè)，p53介導(dǎo)的凋亡通路以線粒體凋亡通路為主。本研究用M18導(dǎo)致SMMC-7721細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C流出，線粒體膜電位下降，說明M18誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過線粒體凋亡通路進(jìn)行。

綜上所述，經(jīng)改造后的氟喹諾酮衍生物M18明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并有較好的選擇抑制作用，M18誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，此作用與線粒體凋亡通路有關(guān)。

Fig 6 Effects of M18 on caspase-3，p53 protein expressions and release of cytochrome C from mitochondria to cytosol in SMMC-7721 cells

參考文獻(xiàn):

［1］Rhee H K，Park H J，Lee S K，et al.Synthesis，cytotoxicity，and DNA topoisomerase II inhibitory activity of benzofuroquinolinediones［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(4) :1651－8.

［2］McClendon AK，Osheroff N.DNA topoisomerase II，genotoxicity，and cancer［J］.Mutat Res，2007，623(1－2) : 83－97.

［3］Pogorelˇcnik B，Perdih A，Solmajer T.Recent developments of DNA poisons-human DNA topoisomerase IIα inhibitors-as anticancer agents［J］.Curr Pharm Des，2013，19(13) : 2474－88.

［4］Williams G M，Brunnemann K D，Smart D J，et al.Relationship of cellular topoisomerase IIalpha inhibition to cytotoxicity and published genotoxicity of fluoroquinolone antibiotics in V79 cells［J］.Chem Biol Interact，2013，203(2) : 386－90.

［5］Shi Z Y，Li Y Q，Kang Y H，et al.Piperonal ciprofloxacin hydrazone induces growth arrest and apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33(2) : 271－8.

［6］付建民，王德輝，孫金平，等.對(duì)甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(6) :801－5.

［6］Fu J M，Wang D H，Sun J P，et al.p-Methoxycinnamaldehyde levofloxacin-3-ylhydrazone induces apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27 (6) : 801－5.

［7］Sun J P，Shi Z Y，Liu S M，et al.Trimethoxy-benzaldehyde levofloxacin hydrazone inducing the growth arrest and apoptosis of human hepatocarcinoma cells［J］.Cancer Cell Int，2013，13(1) : 67.

［8］任爭(zhēng)，康玉華，石貞玉，等.肉桂醛氧氟沙星酰腙誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(9) :1109 －15.

［8］Ren Z，Kang Y H，Shi Z Y，et al.Cinnamaldehyde ofloxacin-3-ylhydrazone induces apoptosis of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells［J］.Acta Pharm Sin，2010，45(9) : 1109－15.

［9］皇甫超申，馬永超，房娜，等.三氮唑席夫堿衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞分化和凋亡的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(4) : 498－503.

［9］Huangfu C S，Ma Y C，F(xiàn)ang N，et al.Effects of trizole Schiff base derivative on the differentiation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(4) : 498－503.

［10］Kamat A M，DeHaven J I，Lamm D L.Quinolone antibiotics: a potential adjunct to intravesical chemotherapy for bladder cancer ［J］.Urology，1999，54(1) : 56－61.

［11］胡國(guó)強(qiáng)，毋曉魁，王新，等.氟喹諾酮C3雜環(huán)取代衍生物的合成及抗腫瘤活性研究(I) :環(huán)丙沙星噻二唑希夫堿［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(11) :1112－5.

［11］Hu G Q，Wu X K，Wang X，et al.Synthesis and antitumor activity of C3 heterocyclic-substituted floroquinolone derivatives (I) : ciproflxacin aminothiodiazole Schiff-bases［J］.Acta Pharm Sin，2008，43(11) : 1112－5.

［12］You Q D，Li Z Y，Huang C H，et al.Discovery of a novel series of quinolone and naphthyridine derivatives as potential topoisomerase I inhibitors by scaffold modification［J］.J Med Chem，2009，52(18) :5649－61.

［13］Sheng Z，Cao X，Peng S，et al.Ofloxacin induces apoptosis in microencapsulated juvenile rabbit chondrocytes by caspase-8-dependent mitochondrial pathway［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008，226(2) :119－27.

［14］Smart D J，Halicka H D，Traganos F，et al.Ciprofloxacin-induced G2 arrest and apoptosis in TK6 lymphoblastoid cells is not dependent on DNA double-strand break formation［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(1) :113－9.

［15］E Kuranaga.Beyond apoptosis: caspase regulatory mechanisms and functions in vivo［J］.Genes Cells，2012，17(2) : 83－97.

Benzaldehyde levofloxacin schiff base induces apoptosis of human hepatocarcinoma cells

HUO Fei1，TANG Nai-fu1，F(xiàn)AN Yuan-yuan1，LIU Shi-meng2，ZHANG Ying2，
LIANG Hong-xia1，HU Guo-qiang3，LIU Bin1
(1.Institute of Neurobiology，College of Nursing，2.Huaihe Clinical College，3.College of Pharmacy，Henan University，Kaifeng Henan 475004，China)

Abstract:AimTo study the effect of (S) -1，8-(2-methyl phosphate ethoxy) -6-fluorine-7-(4-methyl- piperazine-1-base) -3-［S-benzyls-based-4-(for nitrobenzene methylene group amino) -1，2，4-all triazole-3 base］-quinoline(1-H) -4-ketone (M18) on apoptosis of hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro.Methods With different concentrations of M18 at different time used to treat SMMC-7721 cells，human breast cancer MB-231cells，human colon cancer HCT-116 cells，human hepatocarcinoma HEPG-2 cells，mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro，the inhibition effects of M18 on cell proliferation were examined by MTT assay.Cell apoptosis was determined using Hoechst 33258 fluorescence staining and TUNEL method.Mitochondrial membrane potential (△ψm) was measured using a high content screening image system.Protein expression of caspase-3，p53 and cytochrome C was detected with Western blot analysis.ResultsTreatment with M18 (4～32 μmol·L(－1)) potently inhibited the proliferation of the cancer cells in time-and dose-dependent manners (the IC(50)value at 24 h in SMMC-7721 cells，MB-231cells， HCT-116 cells and HEPG-2 cells was 8.65 μmol· L(－1)，9.37 μmol·L(－1)，12.74 μmol·L(－1)and 9.40 μmol·L(－1)，respectively).In contrast，M18 had weak cytotoxicity against BMSCs with IC(50)value of 38.96 μmol·L(－1).Levofloxacin had weak cytotoxicity against SMMC-7721 cells with IC(50)value of 735.10 μmol·L(－1).Treatment of SMMC-7721cells with different concentrations of M18 for 24 h increased the percentage of the apoptosis cells (P＜0.05) and decreased the mitochondrial membrane potential.In addition，M18 increased protein expression of p53，caspase-3 and the cleaved activated forms of caspase-3 in SMMC-7721 cells.Treatment of SMMC-7721 cells with M18 significantly increased cytochrome C in the cytosol，and decreased cytochrome C in the mitochondrial compartment.ConclusionThe mitochondrialdependent pathways are involved in M18 induction of apoptosis of SMMC-7721 cells.

Key words:fluoroquinolones schiff base; hepatocarcinoma cells; cell proliferation; apoptosis; mitochondrial membrane potential; p53

作者簡(jiǎn)介:霍菲(1990－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤分子藥理學(xué)，E-mail: 805767095@ qq.com;劉彬(1959－)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤分子生物學(xué)，通訊作者，Tel: 0371-23880399，E-mail: lbgood5912@ sina.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 21072045) ;河南省科技廳科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(No 112102310307)

收稿日期:2015－01－25，修回日期:2015－03－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0821－06中國(guó)圖書分類號(hào): R329.25; R735.702.2; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.017