中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子對糖氧剝奪/再灌注誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

孫　瑞，劉　珺，沈玉君，沙曼琪，徐勝春，沈玉先

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.生物藥物研究所，安徽合肥　230032;3.解放軍第306醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京　100010)

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中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子對糖氧剝奪/再灌注誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

孫瑞1，2，3，劉珺1，2，沈玉君1，2，沙曼琪1，2，徐勝春1，沈玉先1，2

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.生物藥物研究所，安徽合肥230032;3.解放軍第306醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100010)

摘要:目的研究中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)對糖氧剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪(OGD) 6 h，再灌注(R) 12 h。在再灌注時期，根據(jù)是否給予重組人MANF蛋白處理(2 μmol·L(－1)，12 h)，將細(xì)胞分為正常對照組(NC)、NC+ MANF組、OGD/R組和OGD/R+ MANF組。隨后光學(xué)顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的改變，MTT法檢測細(xì)胞存活率，PI染色法檢測細(xì)胞死亡率，免疫印跡法檢測內(nèi)源性MANF蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表達(dá)。結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可見OGD/R組SH-SY5Y細(xì)胞胞體變小、變圓，突起縮短或消失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MANF能明顯改善OGD/R誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞存活率下降和死亡率增加。免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn): OGD/R組細(xì)胞內(nèi)源性MANF蛋白表達(dá)增高; ER應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α表達(dá)增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達(dá)明顯高于NC組。給予重組人MANF蛋白可降低OGD/R組GRP78/BiP、CHOP及cleaved caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)論OGD/R可誘導(dǎo)凋亡性ER應(yīng)激; MANF蛋白可通過抑制OGD/R誘導(dǎo)的凋亡性ER應(yīng)激而對SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:糖氧剝奪/再灌注;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;凋亡; MANF;非折疊蛋白反應(yīng);神經(jīng)保護(hù)

組織器官在缺血后進(jìn)行血液再灌注時可能導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的發(fā)生。缺血缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、線粒體及溶酶體損傷。再灌注時期由于氧自由基大量釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥細(xì)胞浸潤等多種因素作用，可引起細(xì)胞代謝和功能障礙，發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激是啟動細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，研究表明ER應(yīng)激參與了心、腦、腎等重要器官缺血再灌注損傷的病理生理過程［1－3］。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)在ER應(yīng)激時特異的表達(dá)上調(diào)［4］，在腦缺血、糖尿病、缺血性心臟病等多種病理狀態(tài)下發(fā)揮保護(hù)作用［5－9］，但MANF的保護(hù)作用機(jī)制尚不十分明確。本研究發(fā)現(xiàn)，MANF蛋白可明顯改善OGD/R誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞狀態(tài)，并對ER應(yīng)激相關(guān)蛋白的改變有抑制作用，尤其是減少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達(dá)。本研究將為理解MANF在缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作 用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及主要試劑SH-SY5Y細(xì)胞為本實驗室保存。高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)、DAPI、PI染料購自美國Sigma公司。ECL底物發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。CHOP/GADD153抗體購自美國Santa Cruz生物公司，MANF、GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、cleaved caspase-3抗體購自美國Abcam公司，α-tubulin抗體購自美國Sigma公司。重組人MANF蛋白由本實驗室自備。Galaxy 170R三氣培養(yǎng)箱購自德國Eppendorf公司，熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素及100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱，隔日換液1次，3～4 d傳代1次。

1.2.2缺血/再灌注損傷模型的建立收集對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，分為NC組和OGD/R組。待細(xì)胞貼壁后OGD/R組在糖氧剝奪期更換為預(yù)熱的無葡萄糖平衡鹽溶液(a glucose-free Earle’s balanced salt solution，BSS) : NaCl 116 mmol·L－1，KCl 5.4 mmol·L－1，MgSO4·7H2O 0.8 mmol·L－1，NaH2PO4·2H2O 1 mmol·L－1，NaHCO326.2 mmol ·L－1，Glycine 0.01 mmol·L－1，CaCl2·2H2O 1.8 mmol·L－1，pH 7.4，放入含1% O2，5% CO2，94% N2，37℃飽和溫濕三氣培養(yǎng)箱中，初以5 L·min－1，30 min后培養(yǎng)箱內(nèi)O2濃度降至1%，持續(xù)充入缺氧混合氣體，維持培養(yǎng)箱內(nèi)O2濃度低于1%，并開始計時，進(jìn)行糖氧剝奪6 h。之后兩組細(xì)胞分別更換為含有2 μmol·L－1重組人MANF蛋白的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2，37℃，飽和濕度培養(yǎng)箱中再灌注12 h。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，并檢測細(xì)胞存活率及死亡率，以及ER應(yīng)激相關(guān)蛋白和促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞存活率接種于96孔板的SH-SY5Y細(xì)胞，在OGD/R處理結(jié)束后加入5 g· L－1MTT溶液10 μL(終濃度為0.5 g·L－1)作用4 h。之后加入150 μL DMSO溶液，使結(jié)晶物甲臜溶解，室溫震蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀，測量吸光度(optical density，OD) 570 nm處各孔的吸光值。各組細(xì)胞存活率/%=(該組OD值均值－空白對照OD值均值)/(NC組OD值均值－空白對照OD值均值)×100%。

1.2.4PI染色檢測細(xì)胞死亡率SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，預(yù)先加入含有5 mg·L－1DPAI的DMEM培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，襯染細(xì)胞核，避光操作。待OGD/R處理結(jié)束后，各孔加入50 mg·L－1PI染料2 μL，室溫孵育5 min，輕混勻后在熒光倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，死亡細(xì)胞核為紅色熒光。隨機(jī)選取5個視野(100×)，Image-Pro Plus軟件計算各視野細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞死亡率。

1.2.5免疫印跡法檢測經(jīng)OGD/R處理后MANF蛋白、ER應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)SH-SY5Y

細(xì)胞接種于6孔板，OGD/R處理結(jié)束后，使用RIPA裂解液(Tris，pH 7.4; 150 mmol·L－1NaCl，1% NP-40，0.25% sodium deoxycholate)提取細(xì)胞總蛋白，煮沸變性后，用15% SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入適當(dāng)稀釋度的一抗，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBS-Triton洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Adobe Photoshop CS5 Extended軟件計算灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

Fig 1 Recombinant human MANF inhibits the decrease of OGD/R-induced cell proliferation

2　結(jié)果

2.1重組人MANF改善OGD/R誘導(dǎo)損傷的SHSY5Y細(xì)胞增殖活性光鏡下可見NC組SH-SY5Y細(xì)胞呈單層貼壁生長，多有突起(Fig 1 A1)。OGD/R組細(xì)胞體積變小，突觸變短或消失(Fig 1 A2)，MANF明顯改善該細(xì)胞的狀態(tài)(Fig 1 A3)。MTT結(jié)果顯示，OGD/R組SH-SY5Y細(xì)胞增殖能力下降，明顯低于NC組(P＜0.01)，OGD+ MANF組細(xì)胞增殖活性明顯高于OGD/R組(P＜0.05) (Fig 1B)。該結(jié)果表明重組人MANF蛋白對OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有抑制作用。

2.2重組人MANF抑制OGD/R誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞死亡PI染色可見NC組及NC+ MANF組僅有少量PI染色陽性細(xì)胞(Fig 2 A2，A5)，而OGD/R組PI染色陽性細(xì)胞明顯多于NC組(P＜0.01) (Fig 2 A8)。OGD/R+ MANF組較OGD/R組死亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，死亡率下降(P＜0.05) (Fig 2 A11)。該結(jié)果表明，重組人MANF蛋白能抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

Fig 2 Recombinant human MANF inhibits OGD/R-induced cell death

2.3OGD/R誘導(dǎo)的ER應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)及MANF的作用用免疫印跡方法檢測ER應(yīng)激相關(guān)蛋白時發(fā)現(xiàn)，OGD/R組SH-SY5Y細(xì)胞ER應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表達(dá)均明顯高于NC組(P＜0.01) (Fig 3)，提示OGD/R可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生ER應(yīng)激。給予重組人MANF蛋白處理后，由OGD/R上調(diào)的GRP78/BiP和CHOP的表達(dá)量均有所降低(Fig 4)。

2.4OGD/R誘導(dǎo)的促凋亡蛋白表達(dá)及MANF的作用在檢測ER應(yīng)激相關(guān)蛋白時發(fā)現(xiàn)，OGD/R組促凋亡蛋白CHOP表達(dá)增加，該結(jié)果提示OGD/R可能誘導(dǎo)了凋亡性的ER應(yīng)激。為了進(jìn)一步驗證該結(jié)果，我們對caspase-3進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，激活性的caspase-3水平也明顯增加(P＜0.01)。這些結(jié)果提示OGD/R可誘導(dǎo)凋亡性ER應(yīng)激(Fig 3)。同時發(fā)現(xiàn)，給予重組人MANF蛋白干預(yù)后，由OGD/R上調(diào)的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制(P＜0.05) (Fig 4)。

Fig 3 Protein levels of endogenous MANF，ER stress-associated proteins，and apoptosis-associatedproteins(performed by Western blot)

3　討論

現(xiàn)已證實，心、腦、肝、腎及胃腸道等多種組織器官都存在缺血/再灌注損傷的現(xiàn)象。缺血/再灌注的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和白細(xì)胞的激活是缺血/再灌注損傷的主要發(fā)病環(huán)節(jié)。近年來的研究表明，ER應(yīng)激在缺血/再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中具有重要作用［1－2，10］。

Fig 4 Recombinant human MANF inhibits the expression of ER stress associated proteins and pro-apoptotic protein induced by OGD/R

ER應(yīng)激是啟動凋亡的主要途徑之一。ER應(yīng)激觸發(fā)了一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞內(nèi)非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)過程。UPR主要通過3種跨膜效應(yīng)蛋白(PERK、IRE1和ATF6)的活化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、修飾及降解，維持ER內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞存活。在生理狀態(tài)下，PERK、IRE1和ATF6與GRP78/BiP結(jié)合而處于抑制狀態(tài)。發(fā)生ER應(yīng)激時，PERK、IRE1和ATF6與GRP78/BiP解離，GRP78/BiP與未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，以促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，同時PERK、IRE1 和ATF6被激活［11］。PERK激活后催化其底物eIF2α發(fā)生磷酸化，使蛋白質(zhì)合成暫停。IRE1α具有激酶和核糖核酸內(nèi)切酶活性，可對XBP1進(jìn)行剪切，生產(chǎn)XBP1的活性形式XBP1s，XBP1s促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊后由ER輸出，并加強(qiáng)錯誤折疊及未折疊蛋白的降解，維持ER的穩(wěn)態(tài)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R可上調(diào)ER應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78/BiP的表達(dá)及激活UPR通路效應(yīng)蛋白IRE1和PERK，提示OGD/R可誘導(dǎo)ER應(yīng)激，導(dǎo)致PERK/eIF2α和IRE1/XBP1s通路激活，模擬體外缺氧缺血誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷過程。

ER應(yīng)激是機(jī)體應(yīng)對損傷的一種保護(hù)性的反應(yīng)，故稱為適應(yīng)性ER應(yīng)激。但當(dāng)刺激因素過強(qiáng)，或ER應(yīng)激持續(xù)存在而超過機(jī)體的代償能力，則ER應(yīng)激變得不可逆，從而出現(xiàn)凋亡性ER應(yīng)激。CHOP是ER應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員［13］，PERK、ATF6以及IRE1都能誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄。在正常情況下CHOP主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，含量很低，細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，CHOP的表達(dá)量大大增加并聚集在細(xì)胞核內(nèi)，過量表達(dá)的CHOP能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。caspase-3是凋亡的關(guān)鍵蛋白，caspase-3經(jīng)剪切后成為活化型caspase-3 (cleaved caspase-3)，水解其蛋白底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)OGD/R可上調(diào)CHOP和cleaved caspase-3的水平，提示OGD/R在凋亡性的ER應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

MANF是神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)家族成員，是1種分泌蛋白，在ER應(yīng)激時特異性的表達(dá)上調(diào)，分子伴侶GRP78/BiP與MANF相互作用，并能調(diào)節(jié)MANF的分泌［1］。近年來的一些研究結(jié)果顯示，MANF作為1個新型的神經(jīng)保護(hù)因子，可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與凋亡相關(guān)蛋白結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［5］。MANF包括兩個結(jié)構(gòu)域:氨基末端的鞘脂激活蛋白樣結(jié)構(gòu)域，可與脂質(zhì)膜相互作用，其羧基末端結(jié)構(gòu)域可能具有保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對ER應(yīng)激的作用。越來越多的證據(jù)表明MANF是1個ER應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在體外實驗中MANF能夠保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對ER應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［4］。晶體結(jié)構(gòu)表明MANF可以幫助蛋白質(zhì)在ER內(nèi)折疊。MANF的C-末端結(jié)構(gòu)域，模體127CKGC130有兩個半胱氨酸形成，一個C-末端二硫鍵可能有助于形成半胱氨酸橋并幫助蛋白質(zhì)折疊，從而減少未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)引起的ER應(yīng)激［15］。本研究探討MANF對OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，再灌注時期給予MANF處理能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力下降，減少OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞死亡率增加，表明MANF能夠減輕OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。此外，Western blot顯示，經(jīng)MANF蛋白處理之后，OGD/R誘導(dǎo)的ER應(yīng)激標(biāo)志物GRP78增加能夠被MANF明顯抑制，并且MANF能夠減少ER應(yīng)激特異的促凋亡蛋白CHOP和凋亡執(zhí)行分子cleaved caspase-3的表達(dá)，表明MANF通過抑制SH-SY5Y細(xì)胞ER應(yīng)激抑制凋亡。因此，MANF在SH-SY5Y細(xì)胞應(yīng)對ER應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷中起著重要的作用。本研究為理解低氧誘導(dǎo)的損傷機(jī)制以及MANF在缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用提供了實驗依據(jù)。

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Protective effects of MANF on oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced apoptotic ER stress in SH-SY5Y neural cells

SUN Rui1，2，3，LIU Jun1，2，SHEN Yu-jun1，2，SHA Man-qi1，2，XU Sheng-chun1，SHEN Yu-xian1，2
(1.School of Basic Medical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Institute of Biopharmaceutical Research，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 3.Dept of Cardiology，the 306th Hospital of PLA，Beijing 100101，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of MANF on human neuroblastoma SH-SY5Y cells suffering fromoxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) and the underlying mechanism.Methods SH-SY5Y cells were treated with OGD for 6 h，followed by reperfusion for 12 h.Meanwhile，the cells were incubated with 2 μmol·L(－1)recombinant human protein MANF for 12 h during reperfusion.The cell morphology was observed under an optical microscope.The cell viability was determined by MTT assay.PI staining was performed to detect the number of dead cells.Western blot was performed to determine the protein levels of endogenous MANF，glucose-related protein 78 (GRP78/BiP)，phosphorylated inositol requiring enzyme 1 (p-IRE1)，phosphorylated eukaryotic translation initiator factor 2α(p-eIF2α)，cleaved caspase-3，and C/EBP-homologous protein (CHOP).Results The cells exposed to OGD/R became smaller and round，and the neurites of the cells were shortened or disappeared.Recombinant human protein MANFbook=815,ebook=80improved the survival rate (P＜0.05) and decreased the death rate (P＜0.05) of SH-SY5Y cells treated with by OGD/R.Western blot assay showed that the endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proteins GRP78/BiP，p-IRE1，p-eIF2α，and MANF were increased significantly after OGD/R treatment，compared with the untreated controls.However，the increases of secretion levels of apoptosis-associated proteins CHOP and cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells induced by OGD/R were significantly suppressed by MANF.Conclusion OGD/R up-regulates the ER stress-associated proteins and causes apoptosis.MANF inhibits OGD/R-induced cell death，which may be related to attenuating ER stress-induced apoptosis.

Key words:OGD/R; ER stress; apoptosis; MANF; UPR; neuroprotection

作者簡介:孫瑞(1984－)，女，碩士生，E-mail: 1246056597@ qq.com;徐勝春(1963－)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:臨床應(yīng)用解剖，通訊作者，Tel: 0551-65161147，E-mail: chun028@163.com;沈玉先(1965－)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:功能性蛋白與藥物作用靶點，通訊作者，Tel: 0551-65113750，E-mail: shenyx@ ustc.edu.cn

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81173074，91129729，81372576)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0810－06中國圖書分類號: R322.81; R329.24; R329.25; R845.22; R977.6

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.015