人參二醇組皂苷提取物對再生障礙性貧血小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究

鄭智茵，尹利明，莊海峰，成　志，趙燕娜，余瀟苓，高瑞蘭

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江杭州　310006; 2.附屬第二醫(yī)院，浙江杭州　310005)

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人參二醇組皂苷提取物對再生障礙性貧血小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究

鄭智茵1，尹利明1，莊海峰1，成志2，趙燕娜1，余瀟苓1，高瑞蘭1

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江杭州310006; 2.附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310005)

摘要:目的觀察自行提取分離的中藥新藥人參二醇組皂苷提取物(PDS-C)對再生障礙性貧血(再障)小鼠促進(jìn)造血和調(diào)節(jié)免疫的作用。方法BALB/c小鼠經(jīng)亞致死量照射后輸入DBA/2小鼠的淋巴細(xì)胞，制成免疫介導(dǎo)型再障模型。實(shí)驗(yàn)分6組，正常小鼠、模型組、PDS-C低、中和高劑量治療組及環(huán)孢素陽性藥物對照組，均灌胃給藥15 d。檢測外周血象、骨髓病理檢查造血組織增生狀況、脾臟T細(xì)胞亞群比例，及T細(xì)胞分化相關(guān)T-bet、GATA-3和FOXP3轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果PDS-C治療再障小鼠的療效明顯，中、高劑量組的外周血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)均明顯高于模型組，骨髓造血組織增生狀況也明顯優(yōu)于模型組。PDS-C升高Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例，降低Th1細(xì)胞比例，并上調(diào)GATA-3和FOXP3蛋白及下調(diào)T-bet蛋白的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)DS-C有效地促進(jìn)造血，改善再障的骨髓抑制，加快造血功能恢復(fù)而升高外周血象;同時通過恢復(fù)再障小鼠失衡的Th1/Th2/Treg細(xì)胞比例而參與調(diào)節(jié)免疫，該文為PDS-C的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:人參二醇組皂苷;再生障礙性貧血;免疫調(diào)節(jié); T細(xì)胞亞群;小鼠;實(shí)驗(yàn)研究

再生障礙性貧血(再障，AA)是一種以造血組織為靶器官的自身免疫性疾病，而Th1細(xì)胞的異?；罨白陨矸磻?yīng)性T細(xì)胞功能亢進(jìn)，導(dǎo)致造血干細(xì)胞過度凋亡、造血微環(huán)境損傷、最終造血衰竭的主要原因［1－2］。目前免疫抑制療法為治療再障的一線方案，但其療效尚不夠理想，且有諸多嚴(yán)重的毒副作用，如肝腎毒性反應(yīng)，并可誘發(fā)惡性腫瘤，存在高花費(fèi)和高風(fēng)險的問題。因此尋找并研究安全有效治療再障的中藥新藥很有必要。我們從人參原料提取分離出人參總皂苷，并進(jìn)一步分離出促進(jìn)造血活性明顯的人參二醇組皂苷提取物(PDS-C)，經(jīng)液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法分析主含5個人參皂苷單體，完成了新藥臨床前研究的實(shí)驗(yàn)和資料23項(xiàng)，成功獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的臨床試驗(yàn)批件，體外研究顯示具有促進(jìn)造血和調(diào)節(jié)免疫的雙重功效，功能主治用于治療多種血細(xì)胞減少癥，如免疫性血小板減少癥和原因不明的白細(xì)胞減少癥［3］，但是PDS-C治療再障的研究尚未見報道。本文制備免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型，采用低、中和高劑量PDS-C治療，通過觀察外周血象、骨髓增生狀況、T細(xì)胞亞群比例及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白等，綜合評價PDS-C治療再障的療效，并探討其調(diào)節(jié)免疫的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和藥物BALB/c小鼠(18～22 g，♂♀不限) 60只，用于制備再障小鼠模型; DBA/2小鼠(18～22 g，♂♀不限) 6只，作為免疫活性細(xì)胞的供體，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。

PDS-C干燥粉劑由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所提取分離，經(jīng)液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，主含5個人參皂苷單體，純度達(dá)到94.2%，生理鹽水配制成工作液。環(huán)孢素由杭州中美華東制藥公司生產(chǎn)，批號為H10960121，生理鹽水配制成工作液。

1.2方法

1.2.1制備免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型按照本研究所建立的方法［4］，無菌取DBA/2小鼠胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝等處的淋巴結(jié)。置200目的不銹鋼過濾網(wǎng)上，輕輕搗碎研磨，生理鹽水沖洗，收集單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109· L－1。BALB/c小鼠經(jīng)60Coγ射線(1.0 Gy，5 min)全身均勻照射后，于4 h內(nèi)自尾靜脈輸入供鼠的淋巴細(xì)胞106/只。

1.2.2PDS-C治療及外周血象檢測60只BALB/c小鼠隨機(jī)分6組，每組10只;包括正常小鼠、模型組、PDS-C低、中和高劑量治療組(20、40和80 mg· kg－1·d－1，劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及臨床患者治療劑量折算)及環(huán)孢素(CsA 50 mg·kg－1·d－1)為陽性對照組。均灌胃給藥治療15 d(相當(dāng)于患者治療10個月的療程)，模型組灌胃等量的生理鹽水。治療7、15 d，分別用ABX血細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠的外周血細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟T細(xì)胞亞群比例

治療后取各組小鼠的脾臟，制備脾臟單個細(xì)胞懸液，按照Th1/Th2和Treg試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。Th1/Th2/Treg細(xì)胞的標(biāo)記方法如下:單個細(xì)胞懸液中分別加入4 μL PMA/Ionomycin和BFA/Monensin混勻，37℃5% CO2培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)4 h，每1 h混勻1次。刺激后，加入CD4-PerCP抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，100 μL FIX＆PERM固定液避光固定，之后分別加入FITC-IFN-γ、APC-IL-4、PE-CD25和APC-FOXP3抗體，避光孵育20 min，PBS洗滌后上機(jī)檢測。以淋巴細(xì)胞設(shè)門，分別記錄5 000個CD4陽性細(xì)胞群內(nèi)IFN-γ+細(xì)胞、IL-4+細(xì)胞和CD25+FOXP3+細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)。

1.2.4Western blot方法檢測小鼠脾臟T-bet和GATA-3和FOXP3蛋白的表達(dá)水平取出各組小鼠的脾臟，按照本研究所建立的方法抽提總蛋白［5］，蛋白定量檢測試劑測定蛋白量，取40 μg總蛋白進(jìn)行100 g·L－1SDS-PAGE電泳，然后40mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜; TBS/T洗膜3次后，分別加入抗小鼠的T-bet GATA-3、TOXP3抗體4℃孵育過夜，再與HRP標(biāo)記的二抗作用，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑(Amersham)作用1 min，采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。

1.2.5骨髓病理取小鼠雙側(cè)下肢骨，置于苦味酸－多聚甲醛固定液中固定，稀鹽酸中脫鈣4～6 h后，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色后觀察骨髓造血組織增生情況。

2　結(jié)果

2.1PDS-C提高再障小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用放射線照射聯(lián)合異基因免疫細(xì)胞輸入制備再障小鼠模型，模型小鼠外周血血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù)分別為(104.2±10.3) g·L－1、(0.8±0.1)和(180.8±12.3)×109·L－1，均明顯低于正常小鼠的(164.2±14.2) g·L－1、(6.62±0.3)和(762.5±46.9)×109·L－1(P均＜0.01)，提示建立該再障模型是成功的。

PDS-C治療AA小鼠，7 d起效，15 d療效明顯，低劑量有效，中、高劑量組的血象3系升高更為明顯，高劑量組最佳。治療15 d，Hb、WBC和PLT計(jì)數(shù)在中劑量組分別為(131.4±13.2) g·L－1、(3.6 ±0.3)和(476.3±39.2)×109·L－1;高劑量組為(144.4±11.2) g·L－1、(4.8±0.5)和(544.2± 41.4)×109·L－1，均明顯高于模型組(P分別＜0.05，0.01)。陽性對照藥環(huán)孢素治療后血象3系也有不同程度地提高，但低于PDS-C中、高劑量組(P分別＜0.05，0.01)。

Fig 1 PDS-C increases peripheral blood countsin aplastic anemia mice

Fig 2 PDS-C regulates percentages of Th1/Th2/Treg cells in aplastic anemia mice

2.2降低再障小鼠Th1細(xì)胞比例，升高Th2和Treg細(xì)胞比例流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠脾臟T細(xì)胞亞群比例，結(jié)果顯示再障小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例(10.4%±1.1%)高于正常對照組(6.0%± 1.0%)，且Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞的比值(17.0%± 2.0%)，高于正常對照組(9.49%±0.9%)，而Treg細(xì)胞比例(6.7%±1.3%)低于正常對照組(10.1% ±1.2%) (P均＜0.01)。

Fig 3 PDS-C regulates expression levels of T-bet，GATA-3and FOXP3 proteins in spleen of AA mice

PDS-C治療再障小鼠15 d，高劑量組Th1細(xì)胞比例(7.2%±0.9%)低于再障模型組(P＜0.05)，中、高劑量組Th2細(xì)胞比例(0.87%±0.1%，1.17%± 0.1%)和Treg細(xì)胞比例(9.9%±0.9%，12.3%± 1.2%)均高于再障模型組(P分別＜0.05，0.01)，且低、中和高劑量組Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞的比值均低于再障模型組(P分別＜0.05，0.01)。此外，高劑量組T細(xì)胞亞群比例與陽性藥物CsA對照組類似。

2.3下調(diào)脾臟T-bet蛋白及上調(diào)GATA3和FOXP3蛋白的表達(dá)Western blot分析各組小鼠脾臟T-bet、GATA-3和FOXP3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示再障小鼠T-bet蛋白表達(dá)水平明顯高于正常小鼠(P＜0.01)，而GATA-3和FOXP3蛋白表達(dá)量則低于正常小鼠(P均＜0.05)，提示再障小鼠T細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的異常性。

PDS-C治療再障小鼠15 d，中、高劑量組T-bet蛋白表達(dá)水平明顯低于再障小鼠(P分別＜0.05，0.01)，而GATA-3和FOXP3蛋白表達(dá)量則高于再障小鼠(P分別＜0.05，0.01)。此外，PDS-C治療組的上述結(jié)果類似于免疫抑制劑CsA治療組，提示PDS-C通過對T-bet、GATA-3和FOXP3蛋白的調(diào)控而發(fā)揮其治療再障的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.4改善再障小鼠的骨髓抑制，促進(jìn)造血功能恢復(fù)Fig 4顯示骨髓病理切片結(jié)果，正常小鼠組骨髓造血組織結(jié)構(gòu)完整，增生活躍，造血島著色均勻，造血細(xì)胞量豐富。再障模型小鼠骨髓增生低下，造血組織淺染，出現(xiàn)大量空白區(qū)，被脂肪組織代替，造血細(xì)胞量明顯減少，符合再障的骨髓病理。

PDS-C各治療組骨髓抑制狀況有不同程度的改善，中、高劑量組的作用更為明顯，出現(xiàn)造血組織結(jié)構(gòu)修復(fù)現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)較緊密，空白區(qū)少，造血島著色較均勻，造血細(xì)胞量明顯較模型組豐富。此外，CsA陽性對照組的骨髓抑制也有所改善，但不如PDS-C高劑量組明顯，仍可見空白區(qū)，造血細(xì)胞數(shù)量也較少。

3　討論

再生障礙性貧血是一種自身免疫性疾病，表現(xiàn)為骨髓造血功能低下、全血細(xì)胞減少。大多數(shù)患者Th1型效應(yīng)性T細(xì)胞異常增多，Th1/Th2比例嚴(yán)重失衡，異常增多的Th1細(xì)胞浸潤骨髓和/或分泌大量Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α)，直接和間接導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭;而維持體內(nèi)免疫耐受的Treg不僅數(shù)量明顯減少且功能低下，提示機(jī)體免疫耐受功能受損［3］，亦是造成骨髓衰竭的主要原因之一。臨床研究顯示免疫抑制療法治療再障的有效率達(dá)60%～80%，也證實(shí)T細(xì)胞免疫異常是再障發(fā)病的重要機(jī)制［6］。因此，本文觀察PDS-C對免疫介導(dǎo)型再障小鼠的療效，采用免疫抑制劑CsA作為陽性對照。

Fig 4 PDS-C improves myelosuppression status in AA mice (×400)

本文采用照射聯(lián)合異基因免疫細(xì)胞輸入法，成功地制備免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型，骨髓增生極度低下，符合再障的骨髓病理。同時外周血Hb、WBC 和PLT均明顯降低，Th1細(xì)胞比例明顯升高，Treg細(xì)胞減少;同時T-bet蛋白表達(dá)升高，GATA-3和FOXP3蛋白則下降，表明該再障模型從細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)、免疫表型到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白等多層次呈現(xiàn)了與臨床再障患者類似的異常［1－2］，適合用來客觀地評價PDS-C對再障的療效及作用機(jī)制。本文有關(guān)模型治療的劑量和療程，不但參考臨床患者應(yīng)用的劑量和療程，而且考慮到小鼠的壽命遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于人類，故設(shè)計(jì)PDS-C和CsA治療再障小鼠15d，相當(dāng)于臨床CsA治療再障患者10個月，符合CsA常規(guī)治療再障患者的療程需達(dá)到6個月以上。

PDS-C治療再障小鼠的外周血象顯示7 d起效，15 d療效明顯，低劑量有效，中、高劑量組的作用更為明顯。骨髓病理檢查也提示PDS-C中、高治療組骨髓增生狀況明顯優(yōu)于模型組。我們前期報道PDS-C在體外通過有效地刺激人、小鼠骨髓紅系、粒系和巨核系造血祖細(xì)胞增殖而促進(jìn)血細(xì)胞的生成，具有類似造血生長因子樣的效應(yīng)［3］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制療法有效的再障患者，在骨髓恢復(fù)正常造血的同時Th1細(xì)胞比例減少，Th2細(xì)胞比例上調(diào)，Th1/Th2達(dá)到正常平衡狀態(tài)，在T-bet蛋白表達(dá)明顯下調(diào)的同時Treg細(xì)胞數(shù)量增加，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)上調(diào)［7］。T-bet是Th1細(xì)胞專屬的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞活化; GATA-3是Th2細(xì)胞專屬轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞活化［8－9］，F(xiàn)OXP3是Treg細(xì)胞專屬轉(zhuǎn)錄因子［10］。本文PDS-C不但有效地促進(jìn)再障小鼠骨髓造血功能的恢復(fù)，明顯提升外周血象，而且能夠改善Th1/Th2/Treg細(xì)胞比例的失衡，下調(diào)T-bet、上調(diào)GATA-3和FOXP3蛋白的表達(dá)，提示PDS-C對T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用與陽性對照組CsA相似。由此，推測PDS-C可通過抑制免疫介導(dǎo)再障小鼠T-bet的表達(dá)、上調(diào)GATA-3和TOXP3的表達(dá)水平來改善Th1/Th2/Treg細(xì)胞的失衡，從而促進(jìn)造血功能的恢復(fù)和機(jī)體的免疫耐受。

綜上，我們自行提取分離的中藥新藥PDS-C對再障小鼠具有促進(jìn)造血，調(diào)節(jié)免疫的功效，本文結(jié)果為PDS-C的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:本研究在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心和國家中醫(yī)藥管理局血液細(xì)胞分子生物學(xué)三級實(shí)驗(yàn)室完成。)

參考文獻(xiàn):

［1］Sheng W1，Liu C，F(xiàn)u R，et al.Abnormalities of quantities and functions of linker for activations of T cells in severe aplastic anemia［J］.Eur J Haematol，2014，93(3) :214－23.

［2］Ge M，Zheng Y，Li X，et al.Differential expression profile of Th1/Th17/Th2-related chemokines and their receptors in patients with acquired bone marrow failure syndromes［J］.Hum Immunol，2013 Feb;74(2) :176－80.

［3］Gao Ruilan，Chong Beng Hock.Research and development of the effective components of Panaxadiol saponin as new Chinese patent medicine for treating hemocytopenia［J］.Chin J Integr Med，2012，18(12) : 892

［4］Yin L M，Jiang H F，Wang X，et al.Effects of sodium copper chlorophyllin on mesenchymal stem cell function in aplastic anemia mice［J］.Chinese J Integrative Med，2013，19(5) :360－6.

［5］尹利明，趙燕娜，杜文喜，等.人參總皂苷增強(qiáng)成骨分化的間充質(zhì)干細(xì)胞促造血作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2015，31(1) : 45－9.

［5］Yin L M，Zhao Y N，Du W X，et al.Total saponins of panax ginseng enhancing the effect of osteoblast differentiation from mesenchymal stem cell on promotion hematopoiesis［J］.Chin Pharmacol Bull，2015，31(1) :45－9.

［6］Shin S H，Lee J W.The optimal immunosuppressive therapy for aplastic anemia［J］.Int J Hematol，2013，97(5) :564－72.

［7］Garg R，F(xiàn)aderl S，Garcia-Manero G，et al.Phase II study of rabbit anti-thymocyteglobulin，cyclosporine and granulocyte colonystimulating factor in patients with aplastic anemia and myelodysplastic syndrome Immunosuppressive therapy for bone marrow failure［J］.Leukemia，2009，23(7) : 1297－302.

［8］Rengarajan J，Szabo S J，Glimcher L H.Transcriptional regulation of Th1/Th2 polarization［J］.Immunol Today，2000，21(10) : 479－83.

［9］Kaito K，Otsubo H，Usui N，et al.Th1/Th2 lymphocyte balance in patients with aplastic anemia［J］.RinshoByori-Japanese J Cli Pathol，2004，52(7) : 569－73.

［10］Abdallah M1，Attia E A，Saad A A，et al.Serum Th1/Th2 and macrophage lineage cytokines in leprosy; correlation with circulating CD4(+ ) CD25(high) FoxP3(+ ) T-regs cells［J］.Exp Dermatol，2014，23(10) :742－7.

Effects of PDS-C on immunoregulation in mice with aplastic anemia

ZHENG Zhi-yin1，YIN Li-ming1，ZHUANG Hai-feng1，CHENG Zhi2，ZHAO Yan-nan1，YU Xiao-ling1，GAO Rui-lan1
(1.Institute of Hematology，the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China; 2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005，China)

Abstract:AimTo observe the effects of panaxdiol saponins component (PDS-C) extracted and isolatedbook=795,ebook=60from Chinese ginseng herb as new Chinese patent medicine on the promotion of hematopoiesis and the regulation of the immune system in treating mice models with aplastic anemia (AA).Methods For preparation of immune mediated AA models，BALB/c mice were exposed to sublethal doses of 5.0 Gy γ radiation，followed by transplanted lymphocytes from DBA/2 donor mice.The mice models were divided into six groups including normal control，AA model，PDS-C treated groups with lower，medium and higher dosages，cyclosporine (CsA) as positive drug control.Both PDSC and CsA were administered by gastrogavage for 15 days.The peripheral blood cells counts and bone marrow pathological examination were tested，the percentages of Th1/Th2/Treg cells from spleen were measured，the protein expression levels of T-bet，GATA-3 and FOXP3 transcription factors in spleen cells were detected.Results Curative effect of PDS-C on treating AA mice was satisfactory.The peripheral hemoglobin，white blood cells and platelet counts in PDS-C groups with medium and higher doses were significantly higher than those in model control.Meanwhile，PDS-C elevated the percentages of Th2 cells and Treg cells，but decreased the percentage of Th1 cells，as well as upregulated the GATA-3，F(xiàn)OXP3 and down-regulated the T-bet protein levels.ConclusionPDS-C possesses the activities of promoting hematopoiesis obviously.It can improve marrow myelosuppression，enhance the recovery of hematopoiestic function，and elevate the peripheral blood cells counts.PDS-C also pays its immunoregulatory efficacy though recovering from unbalanced Th1/Th2/Treg cells in treating immune mediated AA mice.

Key words:panaxdiol saponins component; aplastic anemia; immune regulation; T cell subsets; mice; experimental studies

作者簡介:鄭智茵(1960－)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向:中西醫(yī)結(jié)合防治血液病，Tel: 0571-87071625，F(xiàn)ax: 0571-87911040，E-mail: z05z01y08@ aliyun.com;高瑞蘭(1952－)，女，碩士，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向:血液病新藥的研發(fā)，Tel: 0571-87071625，F(xiàn)ax: 0571-87911040，E-mail: gaoruilan@126.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81373876) ;浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No 2010C33098)

收稿日期:2015－03－23，修回日期:2015－04－17

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0790－06中國圖書分類號: R-332; R284.1; R392.1; R556.502

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.011