龍陵縣不同時(shí)期栽培鐵皮石斛多糖及生物堿含量比較分析

文美瓊 李璐 楊申明 徐成東 段瑞才 許小陵云南楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，云南 楚雄 675000

龍陵縣不同時(shí)期栽培鐵皮石斛多糖及生物堿含量比較分析

文美瓊 李璐 楊申明 徐成東*段瑞才 許小陵
云南楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，云南 楚雄 675000

目的：比較3年生鐵皮石斛3月枝條的及8月枝條多糖及生物堿含量。方法：采用溶劑提取法提取多糖及生物堿，用分光光度法測定多糖及生物堿含量。結(jié)果：莖部各部位、不同時(shí)期的鐵皮石斛多糖含量在15.66%～26.63%之間，生物堿含量在0.016%-0.021%之間。結(jié)論：多糖含量莖中部最高，其次是莖上部，莖下部含量最低；多糖含量隨生長時(shí)間增長而增加，且在不同生長時(shí)期、不同部位，多糖含量差別較大。生物堿為莖上部含量最高，其次是莖中部，含量最低為莖下部；不同生長時(shí)期除莖下部外，生物堿含量隨生長時(shí)間增長反而減小，但不同部位的鐵皮石斛生物堿含量差別較小。

鐵皮石斛；生物堿；多糖；含量；不同時(shí)期

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的干燥莖，是我國傳統(tǒng)的滋陰名貴中藥，其保健功效日愈為人們所重視。

鐵皮石斛具有養(yǎng)陰生津、止咳化痰、抗腫瘤和抗突變作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛具有降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗疲勞、抗血栓、改善血液流變性、改善眼部球結(jié)膜的微循環(huán)，預(yù)防白內(nèi)障等作用[1-2]。多糖是鐵皮石斛的主要活性成分及特征性成分，其含量與藥理作用有著密切關(guān)聯(lián)，其水溶性多糖還是一類免疫增強(qiáng)劑，具有較強(qiáng)的抗腫瘤生物活性，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能、細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫。生物堿也是石斛中重要的活性成分之一，藥理作用主要表現(xiàn)在抗腫瘤、對心血管和胃腸道抑制作用及止痛退熱等方面[3-4]。石斛堿和多糖的藥理作用能基本反映石斛養(yǎng)陰清熱、益胃生津的功效[5]。

龍陵縣地處云南西南邊陲，境內(nèi)最低海拔535m，最高海拔3001m，氣候類型復(fù)雜，降雨豐富，空氣相對濕度84%。復(fù)雜多樣的氣候環(huán)境造就了復(fù)雜多樣的生物類型，全縣境內(nèi)約有石斛屬植物40余種[6]，石斛產(chǎn)業(yè)是該縣一項(xiàng)特色產(chǎn)業(yè)。

本文通過對產(chǎn)自云南龍陵縣株齡為3年的人工栽培鐵皮石斛3個(gè)月枝條及8個(gè)月枝條莖部多糖及生物堿含量進(jìn)行測定，揭示了在生長期相差較短時(shí)鐵皮石斛多糖及總生物堿含量的變異規(guī)律，對鐵皮石斛質(zhì)量控制、優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛培育及采收時(shí)間有重要的理論價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2100紫外可見分光光度計(jì)[龍尼柯(上海)儀器有限公司]；800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械十廠)；紅外快速恒溫干燥箱(鄄城威瑞科技儀器有限公司)；CP 214C電子天平(奧豪斯儀器有限公司制造)；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大機(jī)械有限公司)；HH-S電熱恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；循環(huán)水真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；PHS-3C型酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑 石油醚、丙酮、無水乙醇、5%苯酚溶液(稱取苯酚100g，加鋁粉0.1g和碳酸氫鈉0.05g，常壓蒸餾，收集182℃餾分，稱取該餾分5g，加100ml蒸餾水混勻后，溶解置于棕色試劑瓶中制得)、濃硫酸、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、溴甲酚綠、氨水、三氯甲烷均為分析純；水為試驗(yàn)室自制超純水。

1.3 材料 D-無水葡萄糖對照品和石斛堿對照品(南京春秋生物工程有限公司)；鐵皮石斛采自云南保山龍陵縣株齡為3年的人工種植鐵皮石斛3個(gè)月及8個(gè)月枝條，并由楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院生物學(xué)教授徐成東鑒定為鐵皮石斛。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定[7]

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取此溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00ml分別置于比色管中，加蒸餾水至2.00ml，各加5%苯酚溶液1.00ml，迅速滴加濃硫酸5.00ml，搖勻，放置5min;置于沸水浴中加熱15min后取出，流水冷卻1min，靜置至室溫;待40min后在490nm波長下測其吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：A=0.01476c+0.01632，r=0.9996。說明葡萄糖濃度在0～50μg/ml范圍內(nèi)濃度c(μg/ml)與吸光度A具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 多糖的提取與精制 將不同時(shí)期鐵皮石斛莖部不同部位洗凈,自然晾干,60℃烘干，粉碎后密封保存?zhèn)溆?。精密稱取樣品粗粉0.500g，用濾紙包好，先加入石油醚30ml回流脫脂1h，再用80%乙醇30ml回流1h，打開濾紙包，待乙醇揮干后加入蒸餾水30ml回流提取3次(1、1、0.5h);趁熱抽濾，三次濾液合并，用0.1%活性炭脫色后，抽濾，濾液水浴濃縮，冷卻后定容到50ml容量瓶中，制得提取液;精確吸取1.00ml提取液置于離心試管中，加入7ml無水乙醇，攪拌，離心(4000r/min)10min，棄去上層清液，沉淀用熱水溶解，定容至10ml，制得樣品液。

精密稱取鐵皮石斛粗粉6.000g，按上述方法進(jìn)行多糖提取，得到的沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，制得多糖精制品，60℃烘干1h后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品液0.40ml，加蒸餾水至2.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，在5～60min時(shí)間范圍每隔5min測定吸光度。結(jié)果樣品液在60min以內(nèi)變化不大，說明樣品在60min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密移取樣品液0.40ml各五份，分別加蒸餾水至2.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，待40min后在490nm波長下測其吸光度。精密度試驗(yàn)測定結(jié)果為RSD= 0.37%(n=5)，表示試驗(yàn)的精密度較好。

2.1.5 葡萄糖與多糖換算因素的測定 精確稱取多糖精制品10mg，定容到100ml容量瓶中，搖勻。取此多糖溶液0.40ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，40min后測定吸光度。按下式計(jì)算換算因素F：

F=m/(C·D)

m多糖質(zhì)量，C為多糖液中的葡萄糖濃度，D為多糖的稀釋因素。測得多糖與葡萄糖換算因素F=2.23。

2.1.6 石斛多糖含量的測定(重復(fù)性試驗(yàn))精密移取鐵皮石斛3個(gè)月枝條莖部各個(gè)部位樣品液各1.00ml，8個(gè)月枝條各部位樣品液0.40ml置于比色管中，加蒸餾水至2.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，40min后在490nm波長下測其吸光度。

按下式計(jì)算樣品中多糖的含量：

式中，Cs為樣品液中葡萄糖濃度(μg/ml)，D為樣品液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因素，V為樣品液體積(ml)，ms為樣品質(zhì)量(μg)。

由表1可知， 3年生鐵皮石斛枝條莖中部多糖含量最高，其次是莖上部，莖下部含量最低；在不同生長期時(shí)，莖部各部位多糖含量隨生長時(shí)間增長而增加，8個(gè)月枝條莖中部多糖含量可高達(dá)26.63%，而3個(gè)月枝條莖中部的多糖含量僅達(dá)20.29%。

鐵皮石斛多糖含量與種質(zhì)資源、生長年限、環(huán)境及栽培條件有關(guān)。本文采集的3年生鐵皮石斛其枝條從3個(gè)月到8個(gè)月這個(gè)期間可能生長明顯減慢，合成的有機(jī)物主要積累在植株體內(nèi)，因此多糖含量顯著上升[8]。2.1.7 回收率試驗(yàn) 精確稱取鐵皮石斛8個(gè)月枝條莖中部粗粉0.500g各三份，分別加入多糖精制品108mg、135mg、162mg，用濾紙包好。按“多糖的提取”方法，制得三份試液。分別取0.40ml于比色管中，加蒸餾水至2.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，待40min后在490nm波長下測其吸光度。測得回收率為100.3%(RSD=0.12%，n=3)。

2.2 生物堿含量測定[7]

2.2.1 石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制濃度為10μg/ml的石斛堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取上述溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00ml置于分液漏斗中，分別加入三氯甲烷稀釋至10.00ml后，依次加入5.00ml pH4.5的緩沖溶液、1.00ml0.04%的溴甲酚綠溶液，劇烈振搖3min后靜置30min，用三氯甲烷浸泡并干燥后的藥棉過濾三氯甲烷層，準(zhǔn)確量取濾液6.00ml于比色管中，加1.00ml 0.01mol/L的氫氧化鈉無水乙醇溶液，搖勻，放置25min。以10.00ml三氯甲烷同樣操作作為空白對照，在620nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，石斛堿濃度c為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為A=0.0016c+0.0006，r=0.9998。表明石斛堿濃度在0～60μg/ml范圍內(nèi)濃度c(μg/ml)與吸光度A具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 生物堿的提取 準(zhǔn)確稱取鐵皮石斛各部位樣品0.5000g，置于125ml磨口圓底燒瓶中，加入30ml石油醚于35℃恒溫水浴中脫脂30min，棄出上清液，揮干石油醚，用少量氨水濕潤，加塞放置30min，準(zhǔn)確加入三氯甲烷10.00ml，稱重，置于水浴鍋中于80℃溫度下恒溫水浴回流提取2h，室溫冷卻20min后補(bǔ)充三氯甲烷至原重，再用三氯甲烷浸泡并干燥后的藥棉過濾，濾液為樣品液。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別吸取2.00ml樣品液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，在620nm波長處間隔，在5～60min時(shí)間范圍每隔5min測定吸光度。結(jié)果表明樣品液在15～40min后顯色基本穩(wěn)定，說明樣品在40min內(nèi)穩(wěn)定性較好。所以本試驗(yàn)均放置25min后再進(jìn)行吸光度的測定。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取樣品液5份各2.00ml于5支分液漏斗中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，在620nm波長處測定吸光度。精密度試驗(yàn)測定結(jié)果為RSD= 4%(n=5)。

2.2.5 總生物堿含量的測定(重復(fù)性試驗(yàn)) 分別稱取鐵皮石斛3個(gè)月及8個(gè)月枝條莖部各部位0.5000g各3份，按照“生物堿的提取”步驟操作制得樣品液，準(zhǔn)確吸取各樣品液2.00ml于125ml梨形分液漏斗中，加8.00ml三氯甲烷稀釋至10.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，在620nm波長處測定吸光度。

由表1可見，3年生鐵皮石斛枝條莖上部生物堿含量最高，其次是莖中部，莖下部含量最低；在不同生長期時(shí)，生物堿含量隨生長時(shí)間增加反而減小(莖下部除外)，但差別較小。2.2.6 回收率試驗(yàn) 稱取樣品3個(gè)月枝條莖上部0.500g 6份，分別加入石斛堿對照品溶液5.00ml3份、10.00ml3份，按照“生物堿的提取”步驟操作，制得6份試液，準(zhǔn)確吸取試液2.00、1.00ml于60ml梨型分液漏斗中，用氯仿稀釋至10.00ml，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)操作，在620nm波長處測定吸光度?；厥章试囼?yàn)結(jié)果為98.40%(RSD= 3.84%，n=6)。

表1 鐵皮石斛多糖及生物堿含量(%)

3 結(jié)論

本文研究環(huán)境及栽培條件一致時(shí)，同一種質(zhì)資源的3年株齡鐵皮石斛3月及8月枝條中莖部各部位多糖及生物堿含量的變化。結(jié)果表明在同一生長時(shí)間的鐵皮石斛多糖含量為莖中部最高，其次是莖上部，莖下部含量最低，不同生長時(shí)期時(shí)多糖含量隨生長時(shí)間增長而增加，8月枝條含量大于3月枝條，且不同生長時(shí)期，不同部位多糖含量差別較大；在同一生長時(shí)間內(nèi)生物堿含量為莖上部最高，其次是莖中部，最低是莖下部，但不同生長時(shí)期，不同部位生物堿含量差別較小。

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Comparative Analysis on Contents of Polysaccharides and Alkaloids inDendrobiumofficinaleCollected in Various Periods at Longling

WEN Mei-qiong LI Lu YANG Shen-ming XU Cheng-dong DUAN Rui-cai XU Xiao-lin

Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University, Chuxiong 675000, Yunnan, P.R .China

Objective The branches ofDendrobiumOfficinalewith three-year growth period have been collected in 3 or 8, and their contents of polysaccharides as well as alkaloids have been analyzed and compared. Method The branches were processed with solvent extraction, their contents of polysaccharides and alkaloids were determined by spectro- photometry. Results The contents of polysaccharide in various parts of stems ranged from 15.66% to 26.63%, while the contents of alkaloid ranged from 0.016% to 0.021%. Conclusion The polysaccharide content at middle section was the largest, then the upside, and finally the downside, the content increased with the growth period of the branch, and varied greatly according to the growth period as well as section; the alkaloids content at upside section was the largest, then the middle, and finally the downside, but the content decreased with the growth period, and varied little according to the growth period or section.

Dendrobiumcandidum；alkaloid；polysaccharide；content

國家自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(31260095)。

文美瓊(1963-)，女，副教授，主要從事分析化學(xué)教學(xué)及天然產(chǎn)物的開發(fā)利用工作。

徐成東(1964-)，男，博士，教授，主要從事植物分類和植物地理研究。

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517(2015)10-0015-03

2015.02.17)