一種簡便易行的組織芯片制作技術(shù)

秦廣琪，魏 巧，顧燕子，向春平，蔡 旭，周曉燕，孫孟紅

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科組織庫，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

一種簡便易行的組織芯片制作技術(shù)

秦廣琪，魏 巧，顧燕子，向春平，蔡 旭，周曉燕，孫孟紅

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科組織庫，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

組織芯片；腫瘤；制作技術(shù)

組織芯片又稱組織微陣列(tissue microarray)是將數(shù)十至數(shù)百個組織芯點(diǎn)按預(yù)先設(shè)計的陣列圖排列在固相載體上形成矩陣的微縮組織塊。1998年Kononen等［1］首次提出組織芯片的概念并證實(shí)了組織芯片的實(shí)用價值，此后組織芯片技術(shù)得到了迅速發(fā)展。其最大潛在作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用同一實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，同時將快速研究大量不同組織樣本(高通量、多樣本)的設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，幾十倍、上百倍地提高組織形態(tài)學(xué)研究的效率，節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料和試劑，同時使實(shí)驗(yàn)結(jié)果有更可靠的可比性，由于其巨大的應(yīng)用潛力和實(shí)用價值，已經(jīng)得到全球科學(xué)家的廣泛關(guān)注。雖然已經(jīng)有不少文章介紹組織芯片技術(shù)及其應(yīng)用，但制作過程相對比較復(fù)雜，本文采用的是UNITMA公司手持式芯片儀，操作簡便，價格低廉，是基層單位都能借鑒的技術(shù)方法。但在技術(shù)操作方面，有些技巧需要注意，本研究旨在介紹一種簡便易行的組織芯片制作技術(shù)及關(guān)鍵環(huán)節(jié)的注意事項(xiàng)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2003年—2011年間保存的淋巴瘤、食道癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、甲狀腺癌組織及正常組織存檔蠟塊及相應(yīng)的HE切片。

1.2 耗材與儀器

優(yōu)質(zhì)切片石蠟，熔點(diǎn)58 ℃購自德國Leica公司；蜂蠟，熔點(diǎn)為65～75 ℃，購自上海華靈康復(fù)器械廠；SuperFrost Plus顯微防脫玻片購自德國MENZEL-GLASER公司；組織芯片儀Quick-Ray購自韓國UNITMA公司；組織切片機(jī)(2145型)購自德國Leika公司。

1.3 組織芯片制作步驟

1.3.1 供體蠟塊選取定位

由病理醫(yī)師對所有蠟塊復(fù)片，鏡下選取有代表性的區(qū)域，用記號筆在HE切片上標(biāo)記該目標(biāo)區(qū)域，然后通過標(biāo)記好的切片與原蠟塊進(jìn)行仔細(xì)比對，將相應(yīng)目標(biāo)點(diǎn)點(diǎn)在供體蠟塊上。一般腫瘤區(qū)域取3個點(diǎn)，正常區(qū)域取1個點(diǎn)，可供鏡下對比觀察。

1.3.2 受體蠟塊

預(yù)鑄的受體蠟塊(Φ1 mm、Φ2 mm、Φ3 mm和Φ5 mm)購自UNITMA公司。本研究均以Φ1 mm(12×10位點(diǎn))的受體蠟塊為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，供體蠟塊組織厚度要達(dá)到2 mm。

1.3.3 組織微陣列的設(shè)計

以食道癌芯片蠟塊陳列設(shè)計為例，一個完整的1 mm孔徑芯片共29例樣本蠟塊(其中包括腫瘤蠟塊及相應(yīng)的正常蠟塊)。根據(jù)預(yù)先的標(biāo)記每個病例選取4個位點(diǎn)，腫瘤組織蠟塊上取3個位點(diǎn)，正常組織蠟塊上取1個位點(diǎn)。癌及正常組織間隔分布，便于閱片時對照。最后4個位點(diǎn)空出，以便于區(qū)分陣列的起尾，便于鏡下定位觀察。組織芯片的深度為2.0～3.0 mm，是實(shí)際蠟塊組織的厚度，一般不會有鉆取蠟塊比受體蠟塊高的現(xiàn)象。

1.3.4 芯片蠟塊的制作

芯片蠟塊的制作過程：① 預(yù)熱：先將供體蠟塊于37 ℃烘箱中預(yù)熱30 min，目的是防止鉆頭取芯時使石蠟塊斷裂，尤其是質(zhì)地比較硬的組織，如宮頸組織等。②點(diǎn)陣：按照組織陣列設(shè)計圖把相應(yīng)的蠟塊按順序排好，用UNITMA公司手持式芯片儀配置的直徑l mm的鉆頭按陣列圖分別鉆取出預(yù)先標(biāo)記的組織位點(diǎn)，然后按照順序分別注入到受體蠟塊的相應(yīng)孔位，壓實(shí)，注意要嚴(yán)格按照陣列圖對號入座，以免對后續(xù)工作造成不可挽回的后果，直至依次將所有樣本植入受體蠟塊中。③ 抹平：將植入芯柱的蠟塊表面抹平，保證組織芯柱在同一平面內(nèi)。組織芯柱若不在同一個面上，往往切不出完整的點(diǎn)數(shù)，不能將所有位點(diǎn)完整用于研究，造成巨大損失。④熔蠟：將組織芯片蠟塊抹平面朝下放入熔蠟框內(nèi)，放入恒溫箱內(nèi)，保證連續(xù)30 min，50 ℃條件下熔蠟。當(dāng)蠟塊達(dá)到要求的溶解狀態(tài)時取包埋筐進(jìn)行包埋，包埋的液體石蠟盡量和受體蠟塊的熔點(diǎn)接近，包埋前用手輕輕擠壓受體蠟塊把液體蠟內(nèi)的氣泡擠出保證芯柱和受體蠟?zāi)芫o密結(jié)合在一起；經(jīng)過步驟③ 和④ ，組織芯可自然落在同一個平面上，直至包埋，一直維持朝下的位置，不會造成高低不平的現(xiàn)象。如果是供體組織塊本身高度不一，應(yīng)在選取組織塊時不用那些過于薄的組織，或可以選擇兩次重復(fù)取樣，在一個芯的位置放置兩個薄芯，疊加后和彌補(bǔ)原蠟塊太薄的不足，技術(shù)上稱為stacking(堆垛)。⑤ 制作完成及蠟塊貯存：將包埋處理好的蠟塊放入速凍臺讓其冷卻，待蠟塊完全冷后將其從熔蠟筐內(nèi)剝出修去四周多余的蠟備用。

1.3.5 組織芯片的切片制作

組織芯片的切片制作步驟：① 切片前先將組織芯片蠟塊置于4 ℃冰箱中預(yù)冷4 h，保證每一個組織芯柱的硬度相同，有利于切片的質(zhì)量。取出后固定于切片機(jī)上，耐心調(diào)試切面與刀片的角度，減少修片對組織芯片造成的損失，然后作4 μm厚連續(xù)切片，先涼水漂片，后45 ℃溫水展片，防脫玻片撈片，待自然風(fēng)干后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?切片過程應(yīng)注意不同組織的芯片切片要求不同，如淋巴瘤組織的腫瘤細(xì)胞小且比較豐富，切片要求要薄，盡量切2～3 μm厚，此時注意防止切片形成皺褶。宮頸及乳腺組織的細(xì)胞纖維組織較多，經(jīng)脫水等處理后質(zhì)地變硬，切片時對刀片的磨損較大，容易出現(xiàn)刀痕，應(yīng)仔細(xì)觀察，及時更換刀片，保證切片的質(zhì)量。③ 不同組織類型的腫瘤，質(zhì)地不同，硬度不同，要求不同，但又要在同一平面切出完整、美觀且優(yōu)質(zhì)的切片。因此，多種腫瘤的芯片制片難度較大，所以需要技術(shù)人員能熟練掌握芯片制作技巧，且要極具細(xì)心和耐心地做好每個環(huán)節(jié)，才能保證組織芯片上的每個位點(diǎn)都達(dá)到要求。

1.3.6 組織芯片的染色

以食道癌組織和腸癌組織芯片為例，取相對完整組織芯片切片，按常規(guī)方法進(jìn)行：① HE染色；② Six1、Six4蛋白免疫組織化學(xué)染色；③ CK20和SMA蛋白免疫組織化學(xué)染色；④ 實(shí)驗(yàn)步驟更為復(fù)雜的miRNA原位雜交檢測，包括作為陽性對照的小rRNA以及miRNA185。

2 結(jié) 果

2.1 芯片制作結(jié)果

制備完成的109個芯片蠟塊。芯片中的組織芯點(diǎn)為所需要的組織形態(tài)學(xué)區(qū)域。所有受體蠟塊均未見裂開，組織位點(diǎn)排列整齊，位點(diǎn)無丟失。組織芯柱與受體蠟塊結(jié)合緊密，熔蠟過程中均未見明顯氣泡產(chǎn)生。每個蠟塊均能切出120張完整的芯片切片，其余因?yàn)榻M織芯柱的組織薄厚不一，一般不能保證芯片上所有組織位點(diǎn)的完整。切好的組織芯片及芯片蠟塊均放在-20 ℃冰箱保存。

2.2 芯片HE染色結(jié)果

以食道癌組織芯片為例，制備完畢抽取一套完整切片進(jìn)行HE。HE染色個別位點(diǎn)有脫片現(xiàn)象，其他位點(diǎn)組織形態(tài)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)均清晰可辨(圖1)。

2.3 芯片免疫組織化學(xué)染色及miRNA原位雜交結(jié)果

食管癌中Six1、Six4蛋白免疫組織化學(xué)染色均特異性表達(dá)(圖2)，腸癌組織中CK20和被侵犯的腸壁平滑肌中SMA表達(dá)、CK20只在上皮性癌組織中表達(dá)和SMA只在平滑肌組織中表達(dá)也均有很好的特異性(圖3)。本研究利用步驟更為復(fù)雜的原位雜交技術(shù)分析miRNA在食管鱗癌組織芯片腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)(陽性對照小rRNA-5S和miR-185)(圖4)。除個別位點(diǎn)消化過程中脫片，其他位點(diǎn)完好無損，且某單個位點(diǎn)脫落不影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。以上結(jié)果證明，我們的組織芯片制作技術(shù)的成熟，已達(dá)到技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖 4 食管鱗癌組織中rRNA-5S(A)和miR-185原位雜交陽性結(jié)果(B)Fig. 4 Positive expression of rRNA-5S (A) and miR-185 (B) in the in situ hybridization staining

3 討 論

組織芯片制作是一種點(diǎn)取石蠟包埋組織中具有代表性的組織位點(diǎn)按一定的規(guī)律重新排列的技術(shù)，組成組織微陣列，可以將許多樣本集中在一張切片上進(jìn)行免疫組化、原位雜交和原位PCR等實(shí)驗(yàn)。組織芯片與傳統(tǒng)石蠟切片相比其在實(shí)驗(yàn)條件的均一性，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、科學(xué)性、可比性幾個方面都能夠體現(xiàn)其優(yōu)越性［2-4］。

鑒于組織芯片在實(shí)驗(yàn)研究中的優(yōu)越性，為了更好地服務(wù)科研，我院組織庫開展組織芯片技術(shù)。從本研究結(jié)果可見，我們制作組織芯片的技術(shù)成熟，制作的組織芯片質(zhì)量良好，可用于科學(xué)研究。由于制作組織芯片涉及較多的蠟塊和切片，制作步驟較多，因此，其操作過程要求細(xì)致精準(zhǔn)，否則組織芯片的完整性就難以保證［5-6］。采用UNITMA公司手持式芯片儀制作的組織芯片可以用于多種用途的研究分析，包括免疫組織化學(xué)染色、原位雜交和熒光原位雜交［7-9］。通過組織芯片制作實(shí)踐，我們總結(jié)以下幾點(diǎn)。① 目標(biāo)組織位點(diǎn)的選?。合瀴K經(jīng)過切片、封蠟、存放等過程，可導(dǎo)致切片和蠟塊上的組織形狀往往不能很好對應(yīng)，使得標(biāo)記好的組織位點(diǎn)從切片到蠟塊的轉(zhuǎn)換過程中產(chǎn)生位置偏離，從而取到無效的組織芯。因此，在組織位點(diǎn)的選取過程中，除了考慮組織形態(tài)的典型性，還要選擇目標(biāo)組織盡量豐富的區(qū)域。細(xì)致的準(zhǔn)備工作非常重要，可以使整個制作事半功倍。② 芯片蠟塊的制作：由于我們使用UNITMA公司預(yù)鑄的受體蠟塊，使得操作步驟和以往手工芯片技術(shù)相比，步驟簡化，操作簡單，減少了出錯的機(jī)會。為了使我們的工作更有效，特總結(jié)幾個小竅門：鉆頭在使用前，可以用二甲苯浸泡除去殘留的蠟，充分干燥后備用；嚴(yán)格按照組織陣列設(shè)計圖操作很重要，注意不要錯點(diǎn)、漏點(diǎn)；操作過程要嚴(yán)格按照預(yù)熱、點(diǎn)陣、抹平、熔蠟及儲存的步驟進(jìn)行。其制作過程相輔相成需要技術(shù)員細(xì)心、耐心。③ 組織芯片的切片：切片前的蠟塊切面校對過程要求嚴(yán)格，操作不易把握。前期角度校對好，可以保證組織薄的位點(diǎn)不至于在修蠟過程中丟失過多。接下來的制片過程，由于我們的受體蠟塊的特殊成分及制作過程的特異性，使我們的整個切片過程簡便易于操作，漂片時不會出現(xiàn)熔蠟、漏點(diǎn)等普通芯片存在的問題。但是組織芯片的每一張切片都是由116個直徑為1 mm的組織點(diǎn)組成，要保證最終切出一張優(yōu)質(zhì)的切片，就要求每個點(diǎn)都要切得完整、美觀，沒有皺褶、刀痕等問題存在。這就對操作人員的技術(shù)水平有相當(dāng)高的要求。④ 組織芯片的染色：組織芯片在染色過程中容易發(fā)生由于各種試劑的涂布不均勻和沖洗后殘留從而影響染色效果的情況，其原因在于芯片各組織位點(diǎn)之間存在空隙，整張芯片并未形成連續(xù)的表面，不利于液體的流動和擴(kuò)散。組織芯片免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，將各步驟間的PBS沖洗步驟由5 min/次×3次改為5 min/次×5次后，背景著色明顯減輕。以上4點(diǎn)是我們制作芯片實(shí)踐中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，希望通過此文能對同行制作芯片有一定的幫助。

組織芯片是一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)高效的實(shí)用技術(shù)。在制備過程中操作人員必須把握好各項(xiàng)操作細(xì)節(jié)，膽大心細(xì)，保證所制備芯片的質(zhì)量。

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2015 AACR“癌癥研究新視野”大會將于上海舉行

繼首屆“癌癥研究新視野”大會在2014年成功舉辦后，美國癌癥研究學(xué)會（AACR）又將于2015年11月12—15日在上海舉辦第二屆“癌癥研究新視野”大會。本次大會將圍繞“如何利用癌癥研究成果造福患者”這一主題，重點(diǎn)介紹癌癥研究各個重要領(lǐng)域最新和最振奮人心的研究成果，為來自全世界各地的研究人員提供寶貴的交流機(jī)會，加強(qiáng)學(xué)術(shù)科研合作。

此次會議將推動癌癥科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，搭建富有活力的平臺，幫助在國際層面上建立全新的合作關(guān)系。4天的會議將吸引來自多個學(xué)科的研究人員參與和互動，學(xué)科范圍將覆蓋整個癌癥研究領(lǐng)域——從基礎(chǔ)研究到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，再到臨床醫(yī)學(xué)。大會將邀請數(shù)十名國內(nèi)外專家發(fā)表主題演講，充分體現(xiàn)高參與性、高互動性及多學(xué)科的特點(diǎn)。會上，我們還將展示第106屆AACR全球年會上的精彩內(nèi)容（2015年4月18—22日，美國賓夕法尼亞州費(fèi)城）。精彩不容錯過！

屆時，將有來自全球各地的1 200多位專家學(xué)者共聚于此，其研究領(lǐng)域包括了實(shí)驗(yàn)性治療、分子靶向治療、化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳與表觀遺傳學(xué)、免疫學(xué)與免疫療法、腫瘤生物學(xué)以及臨床與轉(zhuǎn)化研究等。我們期待您的加入！

會議時間：2015年11月12—15日

會議地點(diǎn)：上海寶華萬豪酒店

會議網(wǎng)站：http://www.aacr.com.cn

論文投稿截止日期：2015年8月10日

注冊參會咨詢熱線：registration@aacr.com.cn，021-23123581

A simple and feasible method of tissue microarray

QIN Guangqi, WEI Qiao, GU Yanzi, XIANG Chunping, CAI Xu, ZHOU Xiaoyan, SUN Menghong
(Tissue Bank of the Department of Pathology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

SUN Menghong E-mail: sunmh@shca.org.cn

Tissue microarray; Tumor; Technology

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.007

R73-3

A

1007-3639(2015)09-0683-04

2014-10-23

2015-03-22）

孫孟紅 E-mail:sunmh@shca.org.cn