熱應(yīng)激對(duì)肉雞血清內(nèi)毒素含量和肝臟中TLR4 m RNA表達(dá)的影響

黃淑成，張義博，黃永宣，劉成蔭，郝世秋，劉 偉，仝宗喜

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002）

熱應(yīng)激對(duì)肉雞血清內(nèi)毒素含量和肝臟中TLR4 m RNA表達(dá)的影響

黃淑成，張義博，黃永宣，劉成蔭，郝世秋，劉 偉，仝宗喜

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002）

為探討肉雞熱應(yīng)激條件下血液內(nèi)毒素對(duì)肝臟TLR4mRNA表達(dá)的影響，我們復(fù)制肉雞熱應(yīng)激模型。應(yīng)用鱟試劑法和分子生物學(xué)等方法檢測(cè)不同熱應(yīng)激時(shí)間段內(nèi)毒素和TLR4mRNA表達(dá)量的變化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞血清內(nèi)毒素與TLR4mRNA在肝臟中的表達(dá)差異均極顯著（P＜0.01）。表明熱應(yīng)激條件下內(nèi)毒素含量的升高可以對(duì)肉雞肝臟造成損傷。

肉雞；熱應(yīng)激；內(nèi)毒素；肝臟；TLR4mRNA

現(xiàn)代過(guò)分追求肉雞的高生長(zhǎng)率使肉雞對(duì)環(huán)境的各種應(yīng)激源表現(xiàn)出很高的敏感性。尤其對(duì)高溫更敏感，特別是高密度飼養(yǎng)的肉雞發(fā)生熱應(yīng)激更為常見(jiàn)。內(nèi)毒素（LPS）是革蘭陰性細(xì)菌外膜的重要成分，也是引起機(jī)體免疫反應(yīng)的成分之一，正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)內(nèi)毒素水平很低，當(dāng)受到外界刺激、環(huán)境改變時(shí)機(jī)體的腸道菌群紊亂，引起內(nèi)毒素移位入血，刺激機(jī)體靶細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的造成休克、多器官功能衰竭甚至死亡［1］。另外，有研究指出，Toll樣受體4（TLR4）是LPS的受體或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用［2］。因此，檢測(cè)LPS受體TLR4在肝臟中的表達(dá)變化對(duì)探討內(nèi)毒素對(duì)肝臟的損傷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物健康的20日齡AA肉雞50只，購(gòu)自河南開(kāi)封正大肉雞繁育基地。

1.2 主要試劑細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、血液內(nèi)毒素檢測(cè)用1號(hào)液體處理劑（批號(hào)：1204240），2號(hào)液體處理劑（批號(hào)：1207090），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)：1209170），定量檢測(cè)用鱟試劑（批號(hào)：1210072）：湛江博康海洋生物有限公司；TRIZol液：Amresric公司生產(chǎn)；RT-PCR試劑盒：美國(guó)Pro?mega公司生產(chǎn)。

1.3 主要器材BET-32M細(xì)菌LPS定量測(cè)定儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司生產(chǎn)；XK96-4型微量振蕩器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司生產(chǎn)；Mastercyder EpRealplex型熒光定量PCR儀：Ep?pendorf公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)分組參照李玉保等［3］肉雞熱應(yīng)激病例模型復(fù)制方法，挑選20日齡AA肉雞50只隨機(jī)分成對(duì)照組（20只）和熱應(yīng)激組（30只），在常規(guī)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行熱應(yīng)激處理。試驗(yàn)開(kāi)始后將熱應(yīng)激組環(huán)境溫度在20 min內(nèi)從（22℃± 1℃）升高至（38℃±1℃）。所有應(yīng)試雞在試驗(yàn)期間應(yīng)禁食，自由飲水。

1.4.2 樣品采集與處理在熱應(yīng)激持續(xù)2、5、10 h時(shí)分別對(duì)熱應(yīng)激組和對(duì)照組肉雞進(jìn)行心臟采血各5 mL，取0.5mL移至含有1號(hào)處理液的離心管中，采用鱟試劑法檢測(cè)血清中內(nèi)毒素含量。采血后將所有受試雞剖殺，取肝臟組織于液氮中保存待測(cè)。

1.4.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)已經(jīng)發(fā)表雞的TLR4基因的mRNA序列［4］運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。TLR4引物序列：上游引物：5′-GAGA?ACCTCAATGCGATGC-3′，下游引物：5′-ATAG?GAACCTCTGACAACG-3′；GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGTGA-3′。由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成（iPAGE級(jí)別）。

1.4.4 RT-PCR方法用TRIZol法對(duì)肝臟組織中TLR4總RNA進(jìn)行提取，最后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用SYBR GreenⅠ對(duì)RT-PCT產(chǎn)物進(jìn)行非特異性標(biāo)記，并使用2-△△CT方法計(jì)算出TLR4mRNA相對(duì)定理表達(dá)結(jié)果。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件的One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并采用GraphPad Prism 5軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)熱應(yīng)激后，對(duì)照組肉雞臨床表現(xiàn)無(wú)明顯變化。熱應(yīng)激組肉雞表現(xiàn)為精神沉郁，活動(dòng)減少，翅膀張開(kāi)，部分肉雞臥于籠底；呼吸困難，張口呼吸，呼吸頻率加快，出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的熱性喘息，可明顯觀察到胸廓快速和劇烈的收縮與擴(kuò)張。另外還發(fā)現(xiàn)部分肉雞的糞便稀薄，飲水增加，用喙啄水沾濕羽毛。

2.2 血清內(nèi)毒素的變化肉雞血清中內(nèi)毒素水平的變化見(jiàn)圖1。隨熱應(yīng)激時(shí)間的持續(xù)，試驗(yàn)組肉雞血清中內(nèi)毒素的含量表現(xiàn)急劇上升的趨勢(shì)，熱應(yīng)激持續(xù)10 h左右時(shí)，血清中內(nèi)毒素的量達(dá)到最高點(diǎn)。與對(duì)照組肉雞相比，熱應(yīng)激2 h時(shí)試驗(yàn)組血清中內(nèi)毒素的含量差異極顯著（P＜0.01）；熱應(yīng)激5 h和10 h時(shí)試驗(yàn)組血清中內(nèi)毒素的含量差異均極顯著（P＜0.01）。

圖1 熱應(yīng)激對(duì)肉雞血清中內(nèi)毒素水平的影響

2.3 TLR4受體mRNA在肝臟中表達(dá)的變化

2.3.1 TLR4受體RT-PCR溶解曲線的建立將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用熒光定量PCR儀將GAPDH和TLR4基因的溶解曲線進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，GAPDH和TLR4的溶解溫度分別是86.5℃和84.3℃。且GAPDH和TLR4溶解曲線都只有一個(gè)波峰，表明RT-PCR在擴(kuò)增過(guò)程中無(wú)引物二聚體產(chǎn)生和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。

2.3.2 mRNA質(zhì)量PCR檢測(cè)經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，所有樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，表明RNA樣品純度較好無(wú)蛋白質(zhì)污染，達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示，肉雞TLR4 mRNA擴(kuò)增片段在200～300 bp之間與預(yù)期的272 bp相一致。肉雞的內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增片段在100～200 bp之間與預(yù)期的156 bp相一致（圖2）。

圖2 熱應(yīng)激肉雞肝臟TLR 4受體m RNA產(chǎn)物凝膠電泳

2.3.3 TLR4受體mRNA在肝臟中的表達(dá)變化肝臟TLR4受體mRNA的相對(duì)表達(dá)變化見(jiàn)圖3，與對(duì)照組肉雞相比，熱應(yīng)激2、5、10 h時(shí)試驗(yàn)組TLR4 mRNA的表達(dá)量均呈差異極顯著（P＜0.01）。同時(shí)，熱應(yīng)激組在熱應(yīng)激持續(xù)2 h時(shí)，TLR4mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的1.021倍；熱應(yīng)激持續(xù)5 h時(shí)，TLR4 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的1.659倍；熱應(yīng)激持續(xù)10 h時(shí)，TLR4 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的3.272倍?？梢?jiàn)，隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR4mRNA的表達(dá)量在迅速上升。

圖3 熒光定量PCR分析TLR4在肝臟中變化

3 討論

3.1 內(nèi)毒素含量的變化肉雞熱應(yīng)激后血清中內(nèi)毒素含量升高，與對(duì)照組相比呈差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。分析其原因可能是由于腸道的微生態(tài)平衡遭到破壞，引起細(xì)菌的大量繁殖與死亡，一方面通過(guò)腸道屏障移位的細(xì)菌和內(nèi)毒素可以引起腸黏膜水腫，腸絨毛膜頂部細(xì)胞壞死脫落，并激活成纖維細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1等細(xì)胞因子破壞腸黏膜的屏障作用［5］；另一方面，腸黏膜缺血缺氧引起腸道產(chǎn)生過(guò)量酸性產(chǎn)物，使細(xì)胞代謝過(guò)程受阻并引發(fā)組織損傷，促使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流而使細(xì)胞組織水腫，引起上皮通透性增加。從而加重細(xì)菌和內(nèi)毒素移位入血［6］。高洪等［7］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素注入山羊靜脈5 h后，肝臟表現(xiàn)明顯的實(shí)質(zhì)細(xì)胞退行性變化，肝小葉壞死，微血管淤血，血管內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘聚等病理變化。這提示內(nèi)毒素能夠引起肝功能損傷，抑制肝臟的解毒和清除機(jī)能。因此，腸道的屏障作用破壞后，大量的內(nèi)毒素和細(xì)菌移位入血，隨血液循環(huán)到達(dá)肝臟引起肝細(xì)胞的破壞，抑制肝臟的解毒功能，從而導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素含量急劇增加，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。

3.2 TLR4受體mRNA在肝臟中的變化有試驗(yàn)顯示，使用具有LPS反應(yīng)缺陷的C3H/HeJ小鼠品系，在Beutler組顯示TLR4是LPS的一個(gè)重要傳感器［8］。有學(xué)者在小鼠進(jìn)行的定點(diǎn)克隆研究中表明，LPS位座編碼一種TLR4，該受體作為L(zhǎng)PS受體復(fù)合物的跨膜成分在轉(zhuǎn)導(dǎo)脂多糖（LPS）信號(hào)時(shí)起重要作用［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4是識(shí)別內(nèi)毒素的主要受體，也是內(nèi)毒素惟一的跨膜信號(hào)受體［9］。由于肝臟是LPS攻擊的第一個(gè)靶器官，另外，革蘭陰性菌引起機(jī)體損傷主要由LPS介導(dǎo)，所產(chǎn)生LPS首先到達(dá)肝臟與肝臟產(chǎn)生的急性期蛋白LBP結(jié)合，形成LPS-LBP復(fù)合物，再由LBP將LPS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面的CDl4上，在分泌蛋白髓樣細(xì)胞分化蛋白-2的作用下與TLR4結(jié)合，TLR4形成同源二聚體信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，主要通過(guò)MyD88-依賴的信號(hào)通路最終增強(qiáng)NF-κB抑制蛋白激酶（IκB kinase，IKK）活性，導(dǎo)致了IκB的磷酸化和降解，解除對(duì)NF-κB的抑制，NF-κB遂發(fā)生轉(zhuǎn)位而進(jìn)入細(xì)胞核，指導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)一系列的細(xì)胞因子、趨化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等。使機(jī)體產(chǎn)生系列的免疫應(yīng)答［10-11］，最終引起肝細(xì)胞的損傷。

熱應(yīng)激刺激時(shí)，血清中內(nèi)毒素含量急劇升高，大量的內(nèi)毒素進(jìn)入肝組織中，激活其特異性受體TLR4，使TLR4在肝臟中的表達(dá)量升高（圖3），高表達(dá)的TLR4能使內(nèi)毒素分子有足夠的跨膜受體延續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)，擴(kuò)大內(nèi)毒素的各種生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)肝臟組織造成損傷。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組肝臟TLR4mRNA表達(dá)量急速升高，在熱應(yīng)激10 h時(shí)達(dá)到最高值，是對(duì)照組TLR4 mRNA的3.272倍。表明LPS刺激肝臟TLR4mRNA的大量表達(dá)。LPS再激活TLR4下游信號(hào)途徑，使NF-κB激活進(jìn)入細(xì)胞核，指導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)TNF-α，IL-6等炎癥因子，加劇肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并使肝細(xì)胞變性、壞死。

可見(jiàn)，熱應(yīng)激對(duì)肉雞機(jī)體的各種損傷過(guò)程中，內(nèi)毒素起到了非常重要的作用，甚至造成肉雞死亡。在肉雞熱應(yīng)激治療過(guò)程中，應(yīng)考慮清除腸道細(xì)菌，降低機(jī)體中內(nèi)毒素的危害作用，建立“菌毒并治”理念。

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Effects of heatstress on serum endotoxin content and the expression of Hepatic TLR4m RNA of Broilers

HUANG Shu-cheng，ZHANG Yi-bo，HUANG Yong-xuan，LIU Cheng-yin，HAO Shi-qiu，LIUWei，TONG Zong-xi
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

To investigate endotoxin-induced changes in hepatic TLR4 receptor mRNA expression in broilers under heat stress，wemade animalmodel of heat stress.The variation of endotoxin content in serum was detected by Limulus reagent test and the endotoxin-specific receptor TLR4 in liver was detected by molecular biologymethods during heat stress.The results showed that the contents of endotoxin in serum and the activity of TLR4mRNA were significantly elevated（P＜0.01）in the testgroupcom?pared with the control group.Our data indicate that heat stress may cause higher purity of endotoxin and hepatic impairment in broilers.

broilers；heat stress；endotoxin；hepatic；TLR4 Cor responding author：TONG Zong-xi

S858.31

A

0529-6005（2015）12-0027-03

2014-10-10

黃淑成（1988-），男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病及中毒病研究，E-mail：121147067@qq.com

仝宗喜，E-mail：tongzx0329@sohu.com