舒泰麻醉對大鼠各腦區(qū)內(nèi)源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影響

唐琦超，鄒 晶，李 妍，劉海玉，馮秀晶，李建男，范宏剛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

舒泰麻醉對大鼠各腦區(qū)內(nèi)源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影響

唐琦超，鄒 晶，李 妍，劉海玉，馮秀晶，李建男，范宏剛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為研究舒泰麻醉對大鼠腦內(nèi)源性H2S含量及其合成酶CBS的影響，借以探討內(nèi)源性硫化氫及其合成酶CBS與麻醉之間的關(guān)系。將24只Wistar大鼠隨機分為對照組（C組），翻正反射消失組（Z1組）和翻正反射恢復(fù)組（Z2組）。各組于相應(yīng)時間點取腦，使用亞甲藍染色法和Western Blot檢測各腦區(qū)內(nèi)源性H2S含量及CBS蛋白表達量。結(jié)果顯示，Z1組腦干和海馬內(nèi)H2S含量較C組均顯著降低，且腦干和海馬內(nèi)CBS蛋白表達量較C組顯著降低，而丘腦內(nèi)CBS蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；Z2組腦干內(nèi)H2S含量較C組顯著降低，而丘腦內(nèi)CBS蛋白表達量較C組顯著升高，且海馬內(nèi)H2S含量與CBS蛋白表達量較其他四個腦區(qū)均顯著升高（P＜0.05）。綜合實驗結(jié)果表明，舒泰與腦中內(nèi)源性H2S及CBS的生成具有一定相關(guān)性。

舒泰；腦；內(nèi)源性硫化氫；胱硫醚β-合成酶

舒泰（Zoletil）作為目前臨床上常用的犬貓全身麻醉劑，主要由唑拉西泮和替來他明（又名噻環(huán)乙胺）組成。舒泰已經(jīng)被證明可以作用于谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元［1］。谷氨酸作為谷氨酸能神經(jīng)元的信號分子，由GABA能神經(jīng)元釋放，可通過脫羧基作用生成GABA。硫化氫（H2S）一直都被認為是有毒氣體，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)可產(chǎn)生內(nèi)源性H2S，作為一種氣體信號分子，其在生理學(xué)和病理生理學(xué)中都具有重要意義。H2S發(fā)揮作用的分子靶點主要包括蛋白質(zhì)、酶、轉(zhuǎn)錄因子以及膜離子通道。胱硫醚β-合成酶（CBS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)生成H2S主要的合成酶。前期實驗發(fā)現(xiàn)［2］，氯胺酮麻醉大鼠在注射外源性H2S后，其蘇醒時間明顯加快，表明硫化氫可加快氯胺酮麻醉蘇醒。而作為舒泰主要成分之一的替來他明，與氯胺酮為同類藥物，其藥理特性相似。因此本試驗擬通過對舒泰麻醉后大鼠各腦區(qū)內(nèi)內(nèi)源性H2S含量及其合成酶CBS蛋白表達量的檢測，借以探究舒泰麻醉在不同作用時間與CBS蛋白表達量可能存在的相關(guān)性并試述其可能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組試驗選取24只雌性Wistar大鼠，購自長春市伊斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，體重200±20 g，試驗前一周置于室溫清潔環(huán)境安靜飼養(yǎng)，自由攝食飲水。將大鼠隨機分為對照組（C組）和舒泰麻醉組（Z組），其中舒泰麻醉組又被分為兩個亞組，即翻正反射消失組（Z1組）和翻正反射恢復(fù)組（Z2組），各組均為8只大鼠。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣C組腹腔注射0.5mL生理鹽水；Z組大鼠按50mg/kg體重腹腔注射舒泰50（法國Vir?bac公司），使大鼠處于正常麻醉狀態(tài)，且在麻醉中保證其體溫、呼吸、血壓、血氧和心率均于安全范圍內(nèi)。其中Z1組和Z2組分別于翻正反射消失和翻正反射恢復(fù)后，C組直接斷頸取腦。將腦組織置于冰面并分離出大腦、海馬、腦干、丘腦及小腦5個腦區(qū)。一分為二，一半放入凍存管內(nèi)，先于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移到-80℃保存。另一半取出待用。

1.2.2 亞甲藍染色法測定H2S含量將另一半腦組織按質(zhì)量與體積比為1∶10的比例加入0.01mol/L PBS，于勻漿器內(nèi)充分研磨后倒入EP管中，離心機中3 000 r/min（4℃）離心10min，取上清液待測。

量取上清液600μL，加入2 mmol/L磷酸鉀400μL，使整個體系的總體積為1 mL，隨后放入錐形瓶內(nèi)充分反應(yīng)，向其中加入0.5mL的1%醋酸鋅，氮氣在錐形瓶口充盈30 s后石蠟?zāi)みM行封口，隨后將錐形瓶轉(zhuǎn)移至37℃水浴中搖床90 min，加入50%三氯乙酸500μL使反應(yīng)終止，37℃水浴60 min后將錐形瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有3.5 mL dH2O的試管中，加20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽500μL和30 mmol/L三氯化鐵400μL，室溫孵育20 min后轉(zhuǎn)移至96孔板，用酶標儀于670 nm處測定吸光度。按照NaHS的標準濃度制作標準曲線，測出溶液中H2S含量。

1.2.3 Western Blot檢測各腦區(qū)CBS蛋白表達量（1）處理樣品：采用RIPA法裂解各腦區(qū)并提取腦組織中總蛋白，然后利用BCA法測定總蛋白濃度，按最終濃度為3μg/μL將樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性，待用；（2）電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉：采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法：配置10%分離膠，5%濃縮膠，每孔上樣量均為30μg，使用Bio-Rad電泳儀，采取恒壓電泳，先80 V將溴酚藍跑至分離膠后，提高電壓到120 V將溴酚藍跑到底。采用恒流濕轉(zhuǎn)，用0.45 nm的PVDF膜，電流設(shè)定為300mA，轉(zhuǎn)膜時間為60min。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂奶粉封閉2 h；（3）一抗和二抗孵育：一抗選取兔抗CBS（Santa Cruz公司）1∶400稀釋，鼠抗β-ac?tin（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）1∶400稀釋，稀釋液為5%脫脂奶粉，4℃過夜孵育。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗（Santa Cruz公司）1∶4 000稀釋，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）1∶6 000稀釋，稀釋液為TBST。二抗室溫孵育2 h；（4）顯影與數(shù)據(jù)處理：通過增強化學(xué)發(fā)光法（ECL），于暗室內(nèi)利用X線膠片獲得目的條帶影像，經(jīng)過顯影和定影后，將結(jié)果掃描進電腦后分析。使用Image J軟件計算灰度值，利用SPSS18.0軟件統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各腦區(qū)內(nèi)H2S含量舒泰麻醉大鼠翻正反射消失后，腦干內(nèi)H2S含量較C組顯著降低9.86%，海馬內(nèi)H2S含量較C組顯著降低15.74%；翻正反射恢復(fù)后，腦干內(nèi)H2S含量較C組顯著降低8.31%，且海馬內(nèi)H2S含量較其他4個腦區(qū)均顯著增多。

表1 舒泰麻醉對不同腦區(qū)內(nèi)H2S含量的影響（-X±S，n=8）

2.2 各腦區(qū)內(nèi)CBS蛋白表達量如表2和圖1所示，使用舒泰大鼠在其翻正反射消失后，腦干和海馬內(nèi)CBS蛋白表達量相較于C組差異顯著且分別降低18.03%和34.42%，而丘腦內(nèi)CBS蛋白表達量顯著升高81.94%；待翻正反射恢復(fù)后，丘腦內(nèi)CBS蛋白表達量與C組相比顯著升高75%，且海馬內(nèi)CBS蛋白表達量較其他四個腦區(qū)顯著升高。

3 討論

內(nèi)源性硫化氫在體內(nèi)合成主要通過3條途徑，即胱硫醚β-合成酶（CBS）途徑，胱硫醚γ-裂解酶（CSE）途徑以及3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）途徑。其中CBS主要分布在大腦、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和胰腺；CSE以主動脈、腸系膜動脈、門靜脈及其他血管組織為主；而3-MST作為近年來被發(fā)現(xiàn)的第3種合成H2S的相關(guān)酶，主要也分布于大腦內(nèi)。CBS和CSE主要位于胞質(zhì)內(nèi)，而3-MST主要存在于線粒體內(nèi)［3］。目前對內(nèi)源性硫化氫的研究大多都集中在其可以增加谷胱甘肽含量從而起到抗氧化應(yīng)激損傷作用，對心血管損傷的細胞保護作用以及起到松弛平滑肌的作用，但探討內(nèi)源性硫化氫與麻醉相關(guān)性的研究相對較少。

表2 舒泰麻醉對不同腦區(qū)內(nèi)CBS蛋白表達量在不同作用時間的影響（-X±S，n=8）

圖1 舒泰麻醉對不同腦區(qū)內(nèi)CBS蛋白表達的影響

從上述結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，使用舒泰麻醉后不同時刻，大鼠各腦區(qū)中內(nèi)源性H2S含量和CBS蛋白表達量的變化也各不相同。因此有理由認為，舒泰能影響大鼠腦中內(nèi)源性H2S含量及CBS蛋白表達量的變化。研究發(fā)現(xiàn)［1］，舒泰可影響腦內(nèi)的谷氨酸濃度。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸作為谷氨酸能神經(jīng)元的信號分子，是GABA的前體，它可以由GABA能神經(jīng)元釋放。存在于大腦皮層和海馬錐體細胞發(fā)出的下行通路內(nèi)，可參與神經(jīng)元之間興奮性突觸傳遞，而由于缺乏細胞外的代謝途徑，谷氨酸被釋放到突觸間隙后被星形膠質(zhì)細胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運體所攝取，轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺后作為合成谷氨酸和GABA的原料［4-5］。替來他明能夠引起大腦皮層抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA含量顯著升高［6］。H2S可以引起Ca2+進入星形膠質(zhì)細胞并向周圍傳播，形成鈣波，在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞之間相互作用，神經(jīng)元引起周圍的星形膠質(zhì)細胞的激活，從而調(diào)節(jié)突觸活動［7］。因此，從實驗結(jié)果中海馬內(nèi)源性H2S含量在翻正反射消失時降低而后在翻正反射恢復(fù)時升高這一現(xiàn)象，我們可以假設(shè)其變化是因為舒泰中的替來他明能引起海馬內(nèi)谷氨酸含量的升高，進而使內(nèi)源性H2S參與星形膠質(zhì)細胞內(nèi)谷氨酸代謝通路的激活，促進GABA生成，從而起到鎮(zhèn)靜、催眠的作用，而后由于翻正反射恢復(fù)，GABA含量逐步降低。因為內(nèi)源性H2S可能參與了這一反應(yīng)過程，這也就為海馬內(nèi)其含量先降低后升高提出一個較為合理的解釋。但就目前試驗結(jié)果來看，仍無法對腦干和丘腦內(nèi)H2S和CBS含量變化的原因提出合理的解釋，需進一步試驗，用以研究其可能存在的機制。

4 結(jié)論

舒泰發(fā)揮全麻作用可能與抑制海馬、腦干和大腦皮層中H2S及CBS含量有關(guān)，腦內(nèi)內(nèi)源性H2S及CBS可能參與了舒泰全身麻醉的調(diào)控。

［1］Lee Y A，Kim J-I，Lee J-W，etal.Effects of Various Anesthetic Protocols on F-18-Flurodeoxyglucose Uptake into the Brains and Hearts of Normal Miniature Pigs（Sus scrofa domestica）［J］.Jour?nal Of the American Association for Laboratory Animal Science，2012，51（2）：246-252.

［2］范宏剛，馮國峰，郭蔚，等.外源性H2S對氯胺酮全麻大鼠麻醉時間、麻醉效果的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44（12）：78-83.

［3］Predmore B L，Lefer D J，Gojon G.Hydrogen sulfide in biochem?istry and medicine［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：119-140.

［4］楊曉運，李智，秦綠葉，等.星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間谷氨酸-谷氨酰胺的代謝偶聯(lián)［J］.生理科學(xué)進展，2003，34（4）：350-352.

［5］方琦.腦內(nèi)組胺及H1受體對星形膠質(zhì)細胞谷氨酸代謝通路的調(diào)控作用［D］.杭州：浙江大學(xué)，2013.

［6］張燕.噻環(huán)乙胺及小型豬復(fù)合麻醉劑（XFM）對大鼠不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［7］Kimura H，Shibuya N，Kimura Y.Hydrogen Sulfide Is a Signaling Molecule and a Cytoprotectant［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：45-57.

Effect of Zoletil on endogenous hydrogen sulfide and cystathionine β-synthase in rat different encephalic regions

TANGQi-chao，ZOU Jing，LIYan，LIU Hai-yu，F(xiàn)ENG Xiu-jing，LIJian-nan，F(xiàn)AN Hong-gang
（College of AnimalMedicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to study the effectof Zoletil on endogenous hydrogen sulfide（H2S）and cystathionineβ-synthase（CBS）in rat different encephalic regions，and explore the correlation among them，24W istar rats were divided random ly into control group（groupC），disappearance of righting reflex（groupZ1）and recovery of righting reflex（groupZ2）.The brain tissues were taken when reaching each time point.The endogenous H2Scontents and CBSprotein expression in differentencephalic regionswere ana?lyzed bymethylene blue staining and western blot.The results showed that the H2S contents and CBS protein expression in groupZIwere significantly decreased in brainstem and hippocampus，and the CBSprotein expression was significantly increased in thala?mus（P＜0.05）.In groupZ2，the H2S contentswere significantly decreased in brainstem，and CBS protein expression was signifi?cantly increased.The H2S contents and CBS protein expression in hippocampuswere significantly increase than those in other en?cephalic regions（P＜0.05）.The results indicate that Zoletil is related with the emergence of endogenoushydrogen sulfide and cysta?thionineβ-synthase in brain.

Zoletil；brain；endogenous hydrogen sulfide；cystathionineβ-synthase

FAN Hong-gang

S865.1+3

A

0529-6005（2015）12-0100-03

2014-06-18

國家自然科學(xué)基金項目（31001092）

唐琦超（1988-），男，碩士生，主要從事動物麻醉研究，E-mail：tang19880205@126.com

范宏剛，E-mail：fanhonggang2002@163.com