牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王宏博，梁春年，包鵬甲，張良斌，裴杰，吳曉云，趙娟花，閻萍（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王宏博，梁春年，包鵬甲，張良斌，裴杰，吳曉云，趙娟花，閻萍*
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

本研究以牦牛的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白3.3（KAP3.3）基因作為研究對(duì)象，通過查詢GenBank中收錄的黃牛KAP3.3基因的mRNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過逆PCR、PCR以及基因克隆測(cè)序的方法首次獲得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS區(qū)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：牦牛KAP3.3基因的CDS區(qū)為297 bp，編碼98個(gè)氨基酸；編碼的蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)含有延伸鏈、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲3種。氨基酸序列與黃牛的完全一致，具有Keratin，high sulphur matrix protein家族的完整結(jié)構(gòu)域。

牦牛；KAP3.3蛋白；CDS區(qū)

角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin associated protein，KAP）作為絨毛的重要蛋白，是毛基質(zhì)的主要成分，與角蛋白中間絲（keratin intermediate filament，KIF）共同構(gòu)成了毛纖維［1］，在毛干的韌性和強(qiáng)度方面具有重要作用。KAP家族基因在決定絨毛的細(xì)度、長(zhǎng)度、強(qiáng)度、彎曲、光澤度、彈性等起了關(guān)鍵作用［2］。KAP6、KAP7和KAP8與羊毛的直徑相關(guān)［3］。而KAP1.1和KAP1.3有一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與羊毛的細(xì)度有顯著相關(guān)性［4］。研究發(fā)現(xiàn)，KAP3.2基因與毛長(zhǎng)和產(chǎn)絨量有一點(diǎn)相關(guān)性［5］。而獺兔KAP3.2基因與其毛密度有關(guān)［6］。KAP家族基因的研究報(bào)道相對(duì)較多，但是關(guān)于KAP3.3基因的相關(guān)報(bào)道卻在國內(nèi)外都未發(fā)現(xiàn)。且研究KAP家族基因的對(duì)象多是綿羊、山羊、人和小鼠，牦牛方面該基因家族的研究尚未見報(bào)道。

牦牛主要分布在青藏高原及其周邊，能夠適應(yīng)嚴(yán)寒等惡劣環(huán)境。牦牛是唯一產(chǎn)絨的牛種，天祝白牦牛是我國稀有珍貴品種，因其全身被白色絨毛而有“祁連白牡丹”等美稱。因天祝白牦牛白色絨毛有利于染色，可在多種商品中使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究其絨毛的生長(zhǎng)特性對(duì)于提高牦牛的產(chǎn)絨量有至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過克隆得到天祝白牦牛KAP3.3基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列，并對(duì)其蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域及功能預(yù)測(cè)、系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究該蛋白生理功能及周期表達(dá)差異做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品、克隆載體及感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)樣品取自甘肅省天祝藏族自治縣，采集天祝白牦牛皮膚組織液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃冰箱中備用；大腸桿菌（E.coil）由大連寶生物公司提供；克隆載體pGEM-T Easy采自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 分子生物學(xué)試劑RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒采自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒由TaKaRa公司提供；瓊脂糖由上海YITO公司提供；瓊脂粉、酵母浸出粉和胰蛋白胨采自O(shè)XOID公司，X-gal、IPTG、Amp采自上海生工生物公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成以GenBank中黃牛KAP3.3基因的mRNA序列（登錄號(hào)：XM_002702188.3）為模板，使用Primer Primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，序列為F：5′-AAGCCACTGATGACACCTCA-3′，R：5′-GAGCCACA GTTAGTTGCAGG-3′，委托上海生工生物公司進(jìn)行合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取皮膚樣品中的總RNA于10月中旬選取1只成年的體質(zhì)健康的雄性天祝白牦牛，將體側(cè)部位絨和毛剪去，用刀片切割皮膚組織，使用RNA提取試劑盒提取牦牛皮膚組織RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將濃度稀釋至500 ng/μL，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成牦牛皮膚組織的cDNA。主要步驟為在PCR管依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase Free dH2O 6 μL，500 ng/μL總RNA 1 μL，混勻后42℃2 min。在以上反應(yīng)中依次加入5×Prime Script Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，RT PrimerMix 1 μL，Prime－Script RT Enzyme Mix 1 μL，混合后42℃15 min，85℃5 s條件下反應(yīng)，得到cDNA，采用NanoDrop2000/2000c分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后，放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，以cDNA為模板，使用2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：模板2 μL，10 mmol/L引物F、R各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)體系：預(yù)變性94℃4 min；變性94℃30 s，退火62.8℃30 s，延伸72℃50 s，循環(huán)30次；72℃10 min。使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒的操作步驟將PCR產(chǎn)物回收并取6 μL加入1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 克隆KAP3.3基因?qū)z測(cè)合格的PCR產(chǎn)物加入含有pGEM-T Easy克隆載體的液體中，并加入T4 DNA連接酶以及Buffer，在16℃水浴鍋中進(jìn)行過夜連接。將過夜連接的質(zhì)粒加入到E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并加入SOC培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取適量涂布于含有X-gal、IPTG和Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12 h。使用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上白色陽性光滑菌落，并將其接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min進(jìn)行過夜培養(yǎng)。依照質(zhì)?；厥赵噭┖械恼f明對(duì)菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行提取，進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定合格的菌液委托上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 KAP3.3基因的生物信息學(xué)分析使用在線軟件Open Reading Frame Finder（ORF Finder）（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）預(yù)測(cè)牦牛KAP3.3基因的開放閱讀框；將牦牛KAP3.3基因編碼蛋白的氨基酸序列輸入到在線軟件ProtScale（http：//web. expasy.org/protscale/）和Protparam（http：//web.expasy. org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)和理化性質(zhì)分析；使用PSORT II（http：//psort.nibb.ac.jp/）在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用在線軟件NetPhos2.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/）、TMHMM ServerV2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和SignalP4.1（http：//www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-4.1/）分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽位點(diǎn)；使用FoldIndex（http：//bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex）在線軟件分析氨基酸序列的無序化特性；使用在線軟件Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；使用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma. html）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用ProtFun 2.2（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)。在GenBank中下載不同物種KAP3.3基因編碼的氨基酸序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析；使用MEGA 5.1軟件進(jìn)行NJ法構(gòu)建KAP3.3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 牦牛KAP3.3基因PCR擴(kuò)增將擴(kuò)增產(chǎn)物加入到1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的條帶與Marker的700 bp基本一致，該片段與696 bp的目的片段大小相符（圖1）。

圖1 牦牛KAP3.3基因的PCR電泳圖

2.2 牦牛KAP3.3基因的克隆及序列分析將克隆測(cè)序的結(jié)果去除載體序列結(jié)果與預(yù)期一致，為696 bp。BLAST分析顯示，與黃牛的相似度高達(dá)99%，可以確定該基因是牦牛KAP3.3基因。ORF Finder在線分析發(fā)現(xiàn)牦牛KAP3.3基因的開放閱讀框?yàn)?97 bp，共編碼98個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖2）。

圖2 牦牛KAP3.3基因開放閱讀框及編碼蛋白序列

2.3 牦牛KAP3.3蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析使用Protparam在線軟件對(duì)牦牛KAP3.3蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KAP3.3蛋白的分子量為10.4162 ku，PI值為5.37，該蛋白包含20種基本氨基酸，含量最高的為Cys（19.4%），含量最低的為L(zhǎng)ys（1%）、Trp（1%）、Met（1%）和Tyr（1%）。帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）有5個(gè)，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）有3個(gè)。

2.3.2 親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析根據(jù)ProtScale在線軟件分析牦牛KAP3.3基因氨基酸序列的親疏水性。由圖3可知，KAP3.3氨基酸序列第5位峰值最高，為1.967；第88位峰值最低為-1.244，平均峰值為-0.49，屬于親水蛋白質(zhì)。蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛KAP3.3蛋白全部氨基酸都在膜的表面，從而證實(shí)該蛋白是一種表面蛋白。

圖3 牛KAP3.3蛋白親疏水性分析結(jié)果

2.3.3 亞細(xì)胞定位分析在線軟件PSORT II對(duì)牦牛KAP3.3蛋白亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析。由表1可知，其分布在線粒體的可能性為21.7%，分布在細(xì)胞核的可能性為34.8%，胞外分泌的可能性為17.4%，分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性為21.7%，分布在細(xì)胞骨架上的可能性為4.3%。因此可以判斷該蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。

表1 牦牛KAP3.3蛋白亞細(xì)胞定位%

2.3.4 磷酸化和信號(hào)肽位點(diǎn)分析依照NetPhos2.0 Server軟件預(yù)測(cè)牦牛KAP3.3基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)可知（圖4），KAP3.3蛋白共有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別是Ser 3個(gè)、Thr 2個(gè)。使用SignalP4.1預(yù)測(cè)KAP3.3蛋白的切割位點(diǎn)以及分泌途徑可知該蛋白沒有信號(hào)肽。

2.3.5 無序化特性及結(jié)構(gòu)域分析根據(jù)FoldIndex軟件分析牦牛KAP3.3蛋白氨基酸序列的無序化特性，可知KAP3.3蛋白中并未發(fā)現(xiàn)無序化區(qū)域。根據(jù)軟件Interpro對(duì)牦牛KAP3.3蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（圖5），可知該序列有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族蛋白的結(jié)構(gòu)域。

2.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用軟件SOPMA預(yù)測(cè)KAP3.3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），可知該蛋白延伸鏈含26個(gè)氨基酸，占26.53%；β轉(zhuǎn)角含3個(gè)氨基酸，占3.06%；無規(guī)卷曲含69個(gè)氨基酸，占70.41%。

2.3.7 功能預(yù)測(cè)在線軟件ProtFun2.2預(yù)測(cè)的結(jié)果（表2）可知，KAP3.3是結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且都是具有酶功能的蛋白，蛋白加粗的表示功能的指向。

2.3.8 系統(tǒng)進(jìn)化分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載以下KAP3.3蛋白的序列：抹香鯨（Physetermacrocephalus）（XM_007129082.1）、黃牛（Bostaurus）（NM_001077103.1）、小須鯨（Balaenoptera acutorostrata）（XM_007177606.1）、人（Homo sapiens）（BC093845.1）、羊駝（V.pacos）（XM_006214297.1）、埃式象鼩（E.edwardii）（XM_006889436.1）、大熊貓（Ailuropoda melanoleuca（David））（XM_002924947.1）。根據(jù)MegAlign軟件進(jìn)行同源性比較分析。圖7顯示，牦牛KAP3.3蛋白跟黃牛的完全一致，相似性為100%。使用MEGA5.10軟件進(jìn)行NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），結(jié)果與同源性分析比較的結(jié)果基本一致，牦牛KAP3.3蛋白與黃牛在同一分支上。

3 討論

絨毛作為畜牧業(yè)重要的副產(chǎn)品，為紡織工業(yè)提供重要的天然纖維原料，KAP基因家族是編碼絨毛纖維的重要結(jié)構(gòu)蛋白。本實(shí)驗(yàn)首次克隆了牦牛KAP3.3基因完整CDS區(qū)，并提交到GenBank（登錄號(hào)：KM514664）。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，KAP3.3基因開放閱讀框長(zhǎng)度為297 bp，編碼98個(gè)氨基酸。編碼蛋白分子量為10.416 2 ku，PI值5.37，為親水性表面蛋白，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能。磷酸化過程是蛋白質(zhì)翻譯后的一個(gè)重要過程，與許多生物學(xué)功能有關(guān)，如DNA損傷修復(fù)［1］、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［7］、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8］、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等［9-12］，牦牛KAP3.3蛋白具有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)。KAP3.3蛋白沒有無序化區(qū)域，而在分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族蛋白的結(jié)構(gòu)域。含有延伸鏈、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲3種二級(jí)結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲含量最高，占70.41%，β轉(zhuǎn)角含量最少，只占3.06%。這3種元件共同決定KAP3.3蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使其具有生物學(xué)功能。

圖4 牦牛KAP3.3蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖5 牦牛KAP3.3蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖6 牦牛KAP3.3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表2 牦牛KAP3.3蛋白的功能預(yù)測(cè)

牦牛和黃牛KAP3.3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其保守性達(dá)100%，但編碼基因BLAST分析結(jié)果顯示其相似度為僅99%，說明編碼部分蛋白的堿基發(fā)生了同義突變。對(duì)高原型藏綿羊KAP3.2的研究發(fā)現(xiàn)該基因處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，且等位基因數(shù)明顯偏低，處于中度多態(tài)，推測(cè)是由長(zhǎng)期遷徙、遺傳漂變及本品種選育過程中產(chǎn)毛性狀受高強(qiáng)度人工選擇導(dǎo)致其高度近交，造成部分等位基因流失有關(guān)［13］。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，牦牛和黃牛的KAP3.3蛋白處于同一個(gè)分支，說明牦牛和黃牛的KAP3.3親緣性較近。來自父系遺傳［14］、母系遺傳［15］及常染色體的研究都顯示牦牛與黃牛的遺傳距離較近，與本研究結(jié)果一致。8個(gè)物種的蛋白相似率達(dá)到了80%以上。說明KAP3.3蛋白比較保守，吳添文［5］通過比較家兔KAP3.3基因序列與小鼠、豬、人、黑猩猩、牛等哺乳動(dòng)物的同源性，發(fā)現(xiàn)均達(dá)80%以上，指出該基因在不同物種中存在著一定差異，但也說明該基因在進(jìn)化過程中相對(duì)保守，其結(jié)果與本研究一致。

圖7 不同物種KAP3.3蛋白相似性分析

圖8 NJ法構(gòu)建KAP3.3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

牦牛KAP3.3基因CDS區(qū)的全長(zhǎng)為297 bp，共編碼98個(gè)氨基酸，該蛋白是親水蛋白，主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，含有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有3種二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有完整的Keratin，high sulphur matrix protein家族結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)保守性較高的蛋白。

［1］張桂山，薛景龍，孫儷敏，等.不同品種綿羊皮膚毛囊中角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白8-1基因差異表達(dá)研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：76-79.

［2］趙志東.KAP9.2基因的群體遺傳變異及羊絨生長(zhǎng)期和休止期基因的表達(dá)研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［3］Parsons Y，Cooper D，Piper L.Evidence of linkage between highlycineyrosine keratin gene loci and wool fibre diameter in a Merino halfib family［J］.Anim Genet，1994，25（2）：105-108.

［4］劉桂芬，田可川，張恩平，等.優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的候選基因分析［J］.遺傳，2007，29（1）：70-74.

［5］吳添文.家兔毛囊發(fā)育規(guī)律及其相關(guān)基因的遺傳效應(yīng)、表達(dá)規(guī)律研究［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2011.

［6］宦霞娟，陳玉林.獺兔KAP和FGF5基因的多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（6）：12-17.

［7］賈樺，楊麗娟，李愛華，等.寧夏灘羊KAP1.1基因多態(tài)性及其與二毛裘皮重要性狀關(guān)系的研究［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（6）：1-5.

［8］劉一飛，范瑞文，董常生.羊駝皮膚KAP3.2基因3'端序列的cDNA克隆及序列分析［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：108-111.

［9］鄧新宇，姜穎，賀福初.磷酸化蛋白質(zhì)及多肽相關(guān)研究的技術(shù)進(jìn)展［J］.遺傳，2007，29（10）：1163-1166.

［10］Kobor M S，Greenblatt J.Regulation of transcription elongation by phosphorylation［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1577（2）：261-75.

［11］Ohkura H.Phosphorylation：polo kinase joins an elite club［J］. Curr Biol，2003，13（23）：R912-R914.

［12］Ruvolo P P，Deng X，May W S.Phosphorylation of Bcl2 and regulation of apoptosis［J］.Leukemia，2001，15（4）：515-522.

［13］王志有，祁全青，陳玉林.高原型藏綿羊KAP基因單核苷酸多態(tài)性分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（10）：120-124.

［14］蔡欣，趙芳芳，孫磊.牦牛與其他家牛屬動(dòng)物SRY基因多態(tài)性及其父系進(jìn)化關(guān)系分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：190-195.

［15］李齊發(fā)，李隱俠，趙興波，等.牦牛線粒體DNA細(xì)胞色素b基因序列測(cè)定及其起源、分類地位研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（11）：1118-1123.

S823.2

：A

：0258-7033（2015）19-0017-05

2014-09-17；

2015-05-31

甘肅牧區(qū)生產(chǎn)生態(tài)生活優(yōu)化保障技術(shù)集成與示范（2012BAD13B05）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院牦牛資源與育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）

王宏博（1977-），男，甘肅莊浪人，博士，副研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物生產(chǎn)，E-mail：hongbo610@163.com

*通訊作者：閻萍，E-mail：pingyan@sohu.com